NovoNGS® ChiTagTM

NovoNGS^® ChiTag^TM
目录号：M058-YH01
产品描述:
NovoNGS^® ChiTag^TM是Tn5与ProteinA的融合蛋白，同时具有Tn5转座酶与ProteinA的活性。基于它的功能，我们将其应用于蛋白质-基因组互作研究的CUT&Tag。CUT&Tag是蛋白质-基因组互作关系研究的新方法，相较于传统的ChIP-Seq具有以下优点：省时高效，所需的细胞量少，背景信号低，可重复性好等优点，甚至可用于单细胞水平测序。CUT&Tag是研究体内蛋白与染色质DNA互相作用的有力工具，对基因调控、表观遗传等研究具有重大意义。
产品用途：
蛋白质-基因组互作研究，表观基因组学研究，代替ChIP-Seq的 CUT&Tag中使用。
转座复合体构建及片段化效果测试：
1) 构建转座复合体
酶与接头摩尔比1:1混合均匀后，25℃孵育1h即可。
反应体系示例，如下：

双链接头混合物（50pmol/μl）	1μl
ChiTagTM（6.5pmol/μl ）	7.7μl

  


制备好的转座体可用于片段化实验，也可-20℃保存。双链接头为单链 Adaptor1 和单链 Adaptor2 分别与单链 ME 退火后形成，单链接头序列附于本页末尾。
2) 片段化效果测试
在20μl片段化体系中，以100ng基因组为模板进行片段化，结果如下：


保存温度：
-20℃ 3个月，长期保存-80℃。
产品包装：

产品组成	12次
NovoNGS® ChiTagTM（6.5pmol/μl）	12μl

质量保证：
经多次柱纯化，SDS-PAGE胶检测仅可见清晰单一的目的条带，PCR方法检测无宿主DNA残留，无核酸内、外切酶污染。
相关产品：

产品名称	货号
NovoNGS® Index Kit for Illumina®	N237
2×Taq Master Mix	E005

附：单链接头序列
Adaptor1:
5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’
Adaptor2:
5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG -3’
ME: 5'-pCTGTCTCTTATACACATCT-3'
CUT&Tag Protocol
（仅供参考，请根据实际需求调整）
自备试剂（12次）：

仪器准备：

试剂配置（12次）：
Digitonin (5%)：将30mg Digitonin溶解于600μl DMSO中。室温下可保存1周，或-20℃冷冻保存。
注意: Digitonin具有毒性，在称量粉末时应特别小心。处理时使用完整的个人防护用品，包括口罩，实验服和手套。注意DMSO可以穿透皮肤。
Binding Buffer：混合200μl 1M HEPES pH 7.5，100 μl 1M KCl，10μl 1M CaCl₂， 10μl 1M MnCl₂，加dH₂O定容至10 ml。4℃下可保存6个月。
Wash Buffer：混合1ml 1M HEPES pH 7.5，1.5ml 5M NaCl，12.5μl 2M spermidine，加dH₂O定容至50ml，加入一片蛋白酶抑制剂混合片剂（Roche Complete Protease Inhibitor EDTA-Free tablet）。4℃下可保存1周。
Dig-wash Buffer: 混合400μl 5% Digitonin，40ml Wash Buffer。4℃下可保存2天。
Antibody Buffer: 混合8μl 0.5M EDTA，6.7μl 30% BSA和2ml Dig-wash Buffer，置于冰上冷却。
Dig-300 Buffer：混合1ml 1M HEPES pH 7.5，3ml 5M NaCl和12.5μl 2 M spermidine，加dH₂O至50ml, 并添加100μl 5% Digitonin (0.01%)和一片蛋白酶抑制剂混合片剂（Roche Complete Protease Inhibitor EDTA-Free Tablet）。无Digitonin的缓冲液可保存1周，但Digitonin应在当天加入，以减少沉淀。
Tagmentation Buffer：混合5ml Dig-300 Buffer和50μl 1M MgCl₂。
实验流程（12个样本）：
1、 细胞预处理（0.5-1h）
注意：在细胞渗透前的所有步骤都在室温下进行，以使细胞受到的应力最小化。建议避免重悬过程中的空化和剧烈的涡旋振荡。
细胞处理：
1) 室温下收集新鲜细胞并计数（该方法可用于每个样本多达10万个哺乳动物细胞的测序），室温下600 × g离心3min，吸去液体；
2) 加入至少1倍体积的Wash Buffer重悬细胞，室温下低速离心（600 × g离心3min），吸去液体；
ConA磁珠处理：
3) 取一支2ml EP管，向管中加入1.2ml Binding Buffer；
4) 轻轻重悬ConA磁珠，取130μl重悬后的ConA磁珠（每10μl ConA磁珠可结合10万个细胞），加入到步骤3）的EP管中，用枪头吹打混匀后放置在磁力架上沉淀（30s-2min）；
5) 完全吸去EP管中的液体，将EP管从磁力架上取下。向EP管中加入1.2ml Binding Buffer，用枪头吹打混匀后，快速离心（<100×g离心3s），将管盖上的液体离心至管中；
6) 将EP管置于磁力架上沉淀（30s-2min），吸去液体后，加入130μl Binding Buffer（10μl /样本）重悬ConA磁珠；
孵育细胞与ConA磁珠：
7) 将步骤2) 收集的细胞重悬于1.2ml Wash Buffer中并转移至2ml EP管中。1100rpm轻柔涡旋振荡时滴加ConA磁珠，在摇床上放置5-10min；
8) 将EP管从摇床上取下，快速离心（<100×g离心3s）后置于磁力架上沉淀（30s-2min），吸去液体。
2、 结合一抗（2h）
1) 向上述吸去液体的2ml EP管中加入800μl预冷的Antibody Buffer重悬细胞，轻柔涡旋振荡，置于冰上，将其分装于12个1.5ml EP管中，每管50μl；
2) 向每管样品中加入0.5-1μl 一抗，轻柔涡旋振荡（默认使用1:50~1:100或抗体说明书推荐的免疫浓度）；
3) 在室温置于摇床上孵育2h。摇动时，液体应留在管的底部和侧面。
3、 结合二抗（1h）
1) 将所有样品管从摇床上取下，快速离心（<100×g离心3s）后置于磁力架上沉淀（30s-2min），吸去液体；
2) 向每管样品中加入二抗与Dig-wash Buffer 1:100的混合物100μl，轻柔涡旋振荡，使溶液接触到大部分或全部ConA磁珠；
3) 将所有样品管置于摇床上，室温孵育30-60min；
4) 将所有样品管从摇床上取下，快速离心（<100×g离心3s）后置于磁力架上沉淀（30s-2min），吸去液体；
5) 向每管样品中加入0.8-1ml Dig-wash Buffer，上下颠倒10次或轻柔涡旋振荡以使溶液接触到大部分或全部ConA磁珠；
6) 重复步骤4)、5) 两次。
4、 结合ChiTag^TM转座体（1.5h）
1) 将所有样品管进行快速离心（<100×g离心3s）后置于磁力架上沉淀（30s-2min），吸去液体；
2) 将ChiTag^TM转座体与Dig-300 Buffer混合，终浓度为1:250（每管样品需100μl）；
3) 向每管样品中滴加100μl ChiTag^TM转座体，在加入转座体的同时轻柔涡旋振荡，使溶液接触到大部分或全部ConA磁珠；
4) 将所有样品管置于摇床上室温孵育1h；
5) 将所有样品管从摇床上取下，快速离心（<100×g离心3s），将所有样品管置于磁力架上沉淀（30s-2min），吸去液体；
6) 向每管样品中加入0.8-1ml Dig-300 Buffer，上下颠倒10次或轻柔涡旋振荡以使溶液接触到大部分或全部ConA磁珠；
7) 重复步骤5)、6) 两次。
5、 片段化（1h）
1) 将所有样品管进行快速离心（<100×g离心3s）后置于磁力架上沉淀（30s-2min），吸去液体；
2) 向每管样品中加入300μl Tagmentation Buffer，在加入的同时轻柔涡旋振荡；
3) 37ºC孵育1h。
6、 DNA提取（1h）
1) 向每管样品中加入10μl 0.5M EDTA，3μl 10% SDS和2.5μl 20mg/ml蛋白酶K，以终止片段化反应并溶解DNA片段；
2) 全速涡旋振荡2s，50ºC孵育1h或37ºC孵育过夜；
3) 向每管样品中加入300μl PCI，全速涡旋振荡2s；
4) 将上述每管样品分别转移至Phase-Lock Tube，16000×g 室温离心3min；
5) 向每管样品中加入300μl氯仿，上下颠倒10次（不可涡旋振荡），16000×g室温离心3min；
6) 将每管样品的水相分别吸取至含有750μl 100％乙醇的1.5ml管中，用枪头吹打混匀；
7) 将所有样品管放在冰上冷却，4ºC 下16000×g离心15min；
8) 小心地倒出液体并在纸巾上沥干，通常没有可见的颗粒；
9) 向每管样品中分别加入1 ml 100％乙醇进行漂洗，4℃下16,000×g离心1min；
10) 小心地倒出液体并在纸巾上沥干，自然干燥；
11) 待管干燥后，向每管样品中加入25-30μl 10mM Tris-HCl pH8 1mM EDTA（含1/400 RNAse A）；
12) 37ºC孵育10min，并在4℃下储存或直接进行下一步。
7、 PCR（1h）
1) 对于每管样品，取21μl DNA + 2.5μl 带index 的i5引物（10μM）+ 2.5μl 带index 的i7引物（10μM）至0.2ml EP管中；
2) 每管中加入25μl 2×PCR Master Mix，加dH₂O至总体积为50μl；
3) 混合，快速离心（<100×g离心3s）后放入PCR仪中开始循环程序：

*：72 ºC孵育3min为链置换反应，此步骤不可省略；
**：延伸时间请根据实际情况进行调整。
8、 PCR后处理（30min）
1) 待管冷却后，从PCR仪中取出并向每管中加入1.1倍体积（55μl）Ampure XP Beads，吹打混匀；
2) 将所有管进行快速离心（<100×g离心3s），室温放置10min；
3) 将所有管置于磁力架上沉淀（30s-2min），小心吸去液体后，轻轻加入200μl 80%乙醇，注意不要搅动磁珠；
4) 用移液管吸去每管的液体直至管底，再次加入200μl 80%乙醇；
5) 吸去每管的液体并在快速离心（<100×g离心3s）后用20μl移液管移除剩余的液体，静置干燥4-5min；
6) 从磁力架上取下所有管，每管中加入25μl 10mM Tris-HCl pH8，全速涡旋振荡；
7) 将所有管置于磁力架上沉淀5min；
8) 用移液管将液体移至新的0.5ml管中。
注：
1) 若无ConA磁珠，可使用300×g低速离心3min替代磁力沉淀细胞。
2) 酵母细胞打孔可尝试使用该方案（5×10⁵个细胞，用0.5ml工作浓度为80ug/ml Zymolyase-20T，37ºC 20min）。