Hifair Ⅲ cDNA第一链合成试剂盒

产品信息

产品名称	产品编号	规格	储存
HifairTM Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit	11135ES60	100T	-20℃

产品描述

Hifair^TM Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit是基于Hifair^TM Ⅲ Reverse Transcriptase开发的试剂盒。与Hifair^TM II Reverse Transcriptase相比，Hifair^TM Ⅲ Reverse Transcriptase热稳定性大幅度提高，可耐受高达55℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，非常适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Hifair^TM Ⅲ Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可扩增长达12 kb的cDNA。

试剂盒中包含由总RNA或mRNA合成高质量第一链cDNA所需的所有成分，并提供两种cDNA合成引物：Random Primers和oligo (dT)₁₈，合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。

产品组分

组分编号	组分名称	产品编号/规格
		11135ES50 (50 T)	11135ES70 (200 T)
11135-A	RNase free ddH2O	1 mL	4×1 mL
11135-B	5×HifairTM Ⅲ Buffer	200 μL	4×200 μL
11135-C	HifairTM Enzyme Mix	100 μL	4×100 μL
11135-D	Oligo (dT)18 (50 μM)	50 μL	4×50 μL
11135-E	Random Primers (50 ng/μL)	50 μL	4×50 μL

【注】：1）5×Hifair^TM Ⅲ Buffer包含dNTP。

2）Hifair^TM Enzyme Mix中包含RNase inhibitor。

运输方法

冰袋运输。-20℃保存。有效期1年。

引物选择

1. 若后续为PCR实验

1） 如果模板为真核生物来源，建议选择Oligo (dT)₁₈ ，与真核生物mRNA的3’ Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
2）基因特异性引物(GSP)的特异性最高。但有些情况下，用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成时，可改用Oligo (dT)₁₈或Random Primers重新进行逆转录。
3）Random Primers特异性较低，所有RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA均可作为Random Primers的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源，且使用Oligo (dT)₁₈或基因特异性引物(GSP)无法有效引导cDNA合成时，可使用Random Primers作为引物。

2. 若后续为qPCR实验

建议将Oligo (dT)18和Random Primers混合使用，可使mRNA的各个区域均能以相同效率引发cDNA合成，有助于提高定量结果的重复性。

第一链cDNA合成操作步骤

一、若后续为PCR实验

1. RNA变性（此步为可选步骤，RNA变性有助于打开二级结构，可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。）

组分	使用量
RNase free ddH2O	to 14 μL
Oligo (dT)18 (50 μM) or Random Primers (50 ng/μL)   or Gene Specific Primers(2 μM)	1 μL
	or 1 μL
	or 1 μL
模板RNA	Total RNA: 10 pg -5 μg或mRNA:10 pg-500 ng

65℃加热5 min，迅速置于冰上冷却2 min。简短离心收集反应液后加入下表中的逆转录反应液，并用移液器轻轻吹打混匀。

2. 逆转录反应液配制

组分	使用量
上一步的反应液	14 μL
5×HifairTM Ⅲ Buffer	4 μL
HifairTM Enzyme Mix	2 μL

3. 逆转录程序设置

温度	时间
25℃	5 min
50℃	30-60 min
85℃	5 min

【注】：1）当使用Random Primers时，需25℃，孵育5 min；若使用Oligo (dT)18或Gene Specific Primers，此步可省略；
             2）逆转录温度：推荐使用50℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到55℃。

二、若后续为qPCR实验

1. 逆转录反应液配制

组分	使用量
RNase free ddH2O	to 20 μL
5×HifairTM Ⅲ Buffer	4 μL
Oligo (dT)18 (50 μM)	1 μL
Random Primers (50 ng/μL)	1 μL
HifairTM Enzyme Mix	2 μL
模板RNA	Total RNA: 10 pg -5 μg或mRNA:10 pg-500 ng

2. 逆转录程序设置

温度	时间
25℃	5 min
50℃	30-60 min
85℃	5 min

【注】：逆转录温度：推荐使用50℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到55℃。

※ 逆转录产物可立即用于后续PCR或qPCR反应，也可-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

注意事项

1）所有操作均应在冰上进行，且操作过程应避免RNase污染；

2) 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。