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- NEB
- E6300
- 2026年04月15日
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- 文献和实验
- 技术资料
| 品牌 | 货号 | 产品中文名称 | 产品英文名称 |
|---|---|---|---|
| NEB | E6300 | ProtoScript®cDNA 第一链合成试剂盒 | ProtoScript®First Strand cDNA Synthesis Kit |
| 货号 | 产品中文名称 | 产品英文名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| E6300L | ProtoScript® cDNA 第一链合成试剂盒 | ProtoScript® First Strand cDNA Synthesis Kit | 150 rxns |
| E6300S | ProtoScript® cDNA 第一链合成试剂盒 | ProtoScript® First Strand cDNA Synthesis Kit | 30 rxns |
产品特点
ProtoScript cDNA 第一链合成试剂盒包含 cDNA 合成所需的全部试剂
- 重组 M-MuLV 反转录酶
- 产生长达 10 kb 的 cDNA
- 随附 Oligo-dT 引物、随机引物混合液和无核酸酶水
ProtoScript® cDNA 第一链合成试剂盒含两种经优化的混合液：M-MuLV 酶混合液和 M-MuLV 反应混合液。M-MuLV 酶混合液含 M-MuLV 反转录酶和小鼠 RNase 抑制剂，M-MuLV 反应混合液含 dNTP 和经优化的缓冲液。该试剂盒还包含两种优化的反转录引物和无核酸酶水。锚定的 Oligo-dT 引物 [d(T)23VN] 迫使引物与 polyA 尾的起始端退火。经优化的随机引物混合液能随机并持续性地与整个 RNA 模板配对，包括 mRNA 和无 polyA 尾的 RNA。合成的第一链 cDNA 产物长度可超过 10 kb（图 1）。
成功合成 cDNA 的要素：
RNA 模板
高纯度的完整 RNA 对于灵敏的 RT-PCR 检测至关重要。RNA 的 A260/A280 比值应至少 1.7 或更高。
总 RNA 或 mRNA 均可用于反转录反应。总 RNA 通常足以进行大多数 RT-PCR 分析。不过，如果需要，可以使用 PolyA Spin mRNA 分离试剂盒（NEB #S1560）或 mRNA 磁性分离试剂盒（NEB #S1550）获得 mRNA。
检测所需的 RNA 量取决于目标转录本的丰度。通常推荐使用 1 ng 至 1 μg 的总 RNA 或 0.1-100 ng 的 mRNA。
cDNA 第一链合成反应
RNA 和引物在 70℃ 条件下变性 5 分钟，可以去除阻碍较长 cDNA 合成的二级结构。不过，可以在某些情况下省略此步骤（结果未发表）。
推荐在 42℃ 条件下温育一小时，以获得最高产量和最大长度。不过，许多靶标用较短的温育时间即可进行检测。例如，对于 2 kb cDNA 合成，温育 5 分钟就足够了。
选择反转录引物
Oligo d(T) 引物是大多数实验的，因为它确保所有 cDNA 拷贝在 mRNA 的 3´ 端终止并产生最长的连续 cDNA。锚定的 Oligo-dT 引物 [d(T)23VN] 迫使引物与 polyA 尾的起始端退火，从而防止在 polyA 尾的内部位点开始退火（1）。不过，如果需要，也可以选择另外两种引物。
随机引物混合液是经优化的六聚体和 d(T)23VN 引物混合液。该混合液能随机地与整个 RNA 模板配对，包括 mRNA 和无 polyA 尾的 RNA（例如核糖体 RNA）。随机引物混合液产生的 cDNA 平均长度较短，可用于检测多个短 RT-PCR 产物。随机引物混合液在各种 RNA 模板中均具有良好的性能。
基因特异引物用于 cDNA 合成反应时，cDNA 产物只能用于扩增该转录本。RNA 起始量较低（低于 10 ng）且只需要一种特定的 cDNA 时，使用这种方法可以获得良好的结果。
推荐的引物浓度：
引物：终浓度
OLIGO d(T)23VN：5 μM
随机引物混合液：6 μM
特异引物：0.1–1 μM
备注：以上仅为 E6300 的部分产品信息，如需NEB货号 E6300 的完整产品信息及相关的实验操作手册等等，请通过NEB官网查找对应的货号获取。
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文献和实验CDNA合成第一链试剂盒 #E6500L 150 个反应 7600 生工 SK2027 10次 MMLV第一链合成试剂盒 SK2028 20次 TAKARA D6135 5次 6800 Active Motif 50096 96rxns ReflectionTM 96
性酶切引起的偏差· SuperScript™ II逆转录技术从初始的mRNA材料中得到全长cDNA的百分比很高。SuperScript™ II逆转录酶（RT）的Rnase H活性低，能极大减少第一链合成时RNA的降解。 · GateWay®技术，一种已经深入了解的位点特异性重组系统，介导了文库的构建过程。这使得您的cDNA片段转入到GateWay®供载体以构建整个文库。然后就可以通过GateWay®技术将DNA重组到各种各样的表达载体上。反应保持了原有的方向和开放阅读框，所以不需要多余
胸腺核苷酸（dT）18和随机六聚体引物的混合物的Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒，在独立反应中进行第一链cDNA合成。qRT-PCR以20μl反应量、96孔格式和10μl反应量、384孔格式，用LightCycler®480仪器和2× LightCycler®480 Probes Master，用RealTime ready分析方法进行qRT-PCR。在96孔格式中采用每次反应10 ng的cDNA/RNA浓度，在384孔格式中采用每次反应4 ng的浓度。LightCycler
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