人类基因组DNA定量及质检试剂盒KK4960

　　1、样本涵盖

　　1)福尔马林固定组织样本(FFPE)，其DNA损坏程度较重; 2)激光显微切割捕获的样本;

　　3)提取自流式筛选细胞的DNA 4)血浆或血清中的游离DNA; 5)其他微量或非常珍贵的临床样本。

　　2、qPCR法定量低浓度DNA，结果更准

　　目前二代测序文库构建时，常规主要采用分光光度计和电泳法进行文库的定量(例如NanoDrop、PicoGreen或Bioanalyzer)，而其结果往往与真实结果存在较大的出入，主要缺点体现在：

　　1)样本稀释后定量不准;2)无法区分总DNA中的有效DNA片段;3)对污染物敏感，导致测定的有效目的DNA浓度过高或过低。

　　上图所示，6个2倍浓度梯度稀释的DNA样品，从2.5ng/μl到0.09ng/μl，分别用NanoDrop、PicoGreen、qPCR法进行定量。结果显示qPCR法的结果更准，均匀性更好。

　　3、利用Q-比值来评价模板DNA的质量

　　如上图所示：相同的标准品设置，产生三种标准曲线，扩增高度保守的人类单拷贝数基因，片段长度分别为41bp、129bp、305bp。其中41bp的片段被用来对样本进行绝对定量，而129bp、305bp片段来判断DNA的质量。DNA质量不高会严重影响较长片段的扩增效率，因此可通过Q-129、Q-305与Q-41的比值，来推断样本DNA的质量。通过“Q-比值”，可以推测模板DNA的质量并预测文库构建和测序的成功概率。

　　4、通过Q-比值来预测FFPE来源样本文库构建的成功概率

　　上图：FFPE样本来源DNA的Q-比值与文库构建后产量的关系。样本DNA质量差，直接降低文库扩增的效率，尤其是片段长度稍长的情况下。一般情况下，用较短片段的Q-比值(Q-41)来进行定量，用较长片段的Q-比值(Q-129、Q-305)来判断文库DNA的质量。左图通过Q-比值来推断5个人类FFPE来源DNA样本的质量。这些样本的Q-比值与文库构建(Library Construcion,LC)的质量有非常大的直接关系。(数据来源：Mirna Jarosz和Frank Juhn,Fundation Medicine,Cambridge,MA,USA)。

　　5、通过Q-比值来推测片段大小和测序的质量

　　从人类全基因组测序结果中挑选10个人类基因组样本，其尺寸的实际片段大小(～bp)与预测值相比偏小。

　　所有的样本都是通过标准的文库构建流程进行全基因组测序，模板DNA的起始量为100ng。采用Sage Science Pippin Prep选择片段，切胶选择500bp左右。

　　上图：Q305/Q41的比值由上至下逐渐减低，主要说明：

　　1)样本DNA打断后，片段大小由上至下逐渐降小;2)小片段的存在会影响文库质量;

　　测序的文库片段中小片段的量增多。即使严格进行片段选择，仍然会有很多小片段，这一点通过Q-比值也可以看出。(数据来源：Kathleen Steinmann,Sharon Kim和Maura Costello, Broad Institute,MA,USA)

　　6、产品信息