慢病毒载体构建

专业承接各类裸鼠、大鼠、小鼠、兔等动物模型建立以及后续检测服务，模型建立包含裸鼠皮下瘤、原位瘤、糖尿病模型、胃炎模型、急性肺损伤、肺纤维化、子宫内膜异位、白癜风、痛风、骨缺损、肝纤维化、关节炎、脓毒症、支气管哮喘、抑郁症、白血病、脑缺血再灌注、骨质疏松、酒精性肝病、学习记忆障碍、胃溃疡、急性心肌缺血、感染性休克、肝硬化等动物实验模型建立，以及后续各项检测。

  在生命科学研究领域内，进行实验研究所需要的基本条件可以总括为：实验动物、设备、信息和试剂。实验动物作为生命科学研究中的基本要素之一，在很多领域的科学研究中，充当着非常重要的安全试验、效果试验、标准试验的角色，尤其在药物有效性和安全性评价中发挥着不可或缺的作用。

  安徽乐奥贝生物技术公司可以独立开展包括大鼠、小鼠、裸鼠、豚鼠、兔等常见实验动物在内的动物造模及相关实验，现已熟练掌握近30余种不同类型动物模型的造模方法。

1. 目的基因获取
   • 基因克隆
     • 首先要确定需要插入慢病毒载体的目的基因。可以从多种来源获取目的基因，例如从细胞的 cDNA 文库中通过 PCR 扩增得到。设计特异性引物时，要考虑基因的全长序列以及合适的酶切位点。酶切位点的选择要避免目的基因内部有相同的酶切序列，同时要与慢病毒载体上的多克隆位点相匹配。例如，如果目的基因是一个肿瘤相关基因，如 p53 基因，需要根据其 cDNA 序列设计引物，引物长度一般在 18 - 25 个碱基左右，退火温度要合适，通常在 55 - 65℃之间，以保证 PCR 扩增的特异性和效率。
   • 基因片段纯化
     • PCR 扩增得到的目的基因片段需要进行纯化。可以使用 DNA 纯化试剂盒，其原理是通过硅胶膜吸附 DNA，在不同的盐浓度和洗脱液作用下，去除杂质，如未反应的引物、dNTP 等，得到纯净的目的基因片段。纯化后的 DNA 浓度和纯度可以通过核酸分光光度计进行检测，A260/A280 比值在 1.8 - 2.0 之间表明 DNA 纯度较好。
2. 慢病毒载体选择与处理
   • 载体类型
     • 常见的慢病毒载体有三质粒系统和四质粒系统。三质粒系统包括包装质粒、包膜质粒和转移质粒。包装质粒含有病毒复制和包装所需的基因，如 gag、pol 等；包膜质粒主要编码病毒包膜蛋白，如 VSV - G 蛋白，它决定了病毒的宿主范围和感染效率；转移质粒是用于插入目的基因的载体，其含有长末端重复序列（LTR）等调控元件。四质粒系统则是在三质粒系统的基础上，将部分基因拆分成单独的质粒，以提高安全性和基因表达的可控性。
   • 载体酶切与线性化
     • 在插入目的基因之前，需要对慢病毒载体进行酶切，使其线性化，以方便目的基因的插入。根据载体上的多克隆位点和目的基因两端设计的酶切位点，选择合适的限制性内切酶。例如，如果载体上有多克隆位点有 EcoR I 和 BamH I 酶切位点，且目的基因两端也添加了相应的酶切位点，就可以使用这两种酶对载体进行酶切。酶切反应体系要根据酶的说明书进行配制，一般包括酶、缓冲液、DNA 等，在合适的温度（如 37℃）下孵育数小时。酶切后的载体需要进行琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收线性化的载体片段，回收方法同样可以使用 DNA 回收试剂盒。
3. 目的基因与慢病毒载体连接
   • 连接反应
     • 将纯化后的目的基因和线性化的慢病毒载体按照一定的摩尔比（一般为 3:1 - 5:1）进行连接。连接反应需要使用 DNA 连接酶，如 T4 DNA 连接酶。连接反应体系包括目的基因、载体、连接酶、缓冲液等，在 16℃左右孵育过夜。连接反应的效率可以通过转化实验进行初步验证。
4. 重组载体转化与筛选
   • 转化感受态细胞
     • 将连接产物转化到感受态细胞中，如大肠杆菌 DH5α。感受态细胞是经过特殊处理的细菌细胞，能够高效地摄取外源 DNA。转化过程是将连接产物与感受态细胞在冰上孵育一段时间，然后进行热休克（如 42℃，90 秒），再冰浴，最后加入 LB 培养基复苏细胞。复苏后的细胞可以涂布在含有合适抗生素（如氨苄青霉素）的 LB 琼脂平板上，37℃培养过夜。
   • 重组子筛选
     • 由于慢病毒载体上带有抗生素抗性基因，只有成功转入重组载体的细菌才能在含有抗生素的平板上生长。从平板上挑选单菌落，接种到含有抗生素的 LB 液体培养基中，37℃振荡培养。然后提取质粒 DNA，通过酶切鉴定和测序来确定重组载体是否构建成功。酶切鉴定可以根据目的基因和载体上的酶切位点，用相应的酶进行酶切，电泳观察是否出现预期大小的条带；测序则是最准确的鉴定方法，可以将重组载体的序列与目的基因和原始载体的序列进行比对，确定目的基因是否正确插入到载体中。
5. 慢病毒包装与生产
   • 细胞转染用于包装
     • 将构建好的重组慢病毒载体与包装质粒（如果是三质粒系统）或多个包装质粒（如果是四质粒系统）一起转染到包装细胞系中，如 293T 细胞。转染方法可以采用脂质体转染或电转染等。脂质体转染的原理是利用脂质体与 DNA 形成复合物，通过与细胞膜融合将 DNA 导入细胞；电转染则是通过电场作用使细胞膜通透性增加，从而使 DNA 进入细胞。
   • 病毒收集与浓缩
     • 转染后的包装细胞会产生并分泌慢病毒。在转染后一定时间（一般 48 - 72 小时），收集细胞培养上清液，其中含有大量的慢病毒。为了提高病毒滴度，可以对病毒进行浓缩。常用的浓缩方法有超速离心法和超滤法。超速离心法是通过高速离心，使病毒颗粒沉淀，然后用合适的缓冲液重悬病毒；超滤法是利用超滤膜，根据病毒颗粒和其他杂质分子大小的差异，将病毒浓缩在较小的体积内。收集和浓缩后的慢病毒可以用于后续的细胞感染实验等