co-ip实验

实验原理

实验流程

1. 细胞准备与裂解：
   • 细胞培养至合适密度后，去除培养基，用冰预冷的 PBS 清洗细胞 1-2 次，尽量吸干 PBS。然后加入适量预冷的裂解液，如 RIPA 缓冲液，在冰上孵育一段时间，期间可适当震荡或超声处理，使细胞充分裂解。之后在 4℃条件下，以较高转速离心，将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物分析测试百科网。
   • 组织样本则需先在液氮中研磨成粉末状，再加入裂解液进行裂解。
2. 抗体孵育：取适量细胞裂解物，加入特异性的一抗，4℃缓慢摇动孵育过夜或室温孵育 2 小时左右，使抗体与目标蛋白充分结合分析测试百科网。
3. 与 beads 结合：将 Protein A/G 琼脂糖珠或磁珠用 PBS 洗涤后，加入到抗体 - 蛋白复合物中，4℃缓慢摇动孵育 1-3 小时，使抗体与 beads 充分结合，从而捕获抗原抗体复合物分析测试百科网。
4. 洗涤：加入洗涤缓冲液，如 PBS+0.1% Triton-100，重悬 beads，颠倒数次后离心弃上清，重复洗涤 3-6 次，以去除非特异性结合的蛋白质和杂质分析测试百科网。
5. 洗脱：加入适量的洗脱缓冲液，如 SDS buffer，震荡、离心后取上清，得到洗脱下来的蛋白复合物。
6. 检测与分析：将洗脱下来的蛋白复合物进行 SDS-PAGE 电泳，然后通过 Western blot、银染或质谱等方法进行检测和鉴定。在 Western blot 中，可使用针对目标蛋白或可能与之相互作用的蛋白的抗体进行检测，若检测到相应条带，则表明存在相互作用cusabio.cn。

对照设置

1. Input 组：为阳性对照，即直接利用抗体对细胞裂解液进行 WB 检测，验证细胞裂解液中存在目标蛋白搜狐网。
2. IgG 组：阴性对照组，使用与 IP 抗体同源同型的抗体，如 rabbit IgG、mouse IgG1 等，与等量的裂解液孵育，以排除非特异性结合的干扰。

注意事项

1. 整个实验过程需在冰上或 4℃条件下进行，以防止蛋白降解和相互作用的破坏。
2. 选择合适的裂解液和抗体，裂解液应温和，避免破坏蛋白质间的相互作用，抗体应具有高特异性和亲和力。
3. 严格控制实验条件，如孵育时间、温度、洗涤次数等，以减少非特异性结合和假阳性结果。
4. 注意避免抗体的轻重链污染对结果的影响，可选择合适的抗体种属或特殊二抗等方法解决。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相免疫共沉淀互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。