神经示踪逆向跨单突触病毒RV-EnVA-△G-dsRed

狂犬病毒（RV）简介

狂犬病毒（rabies virus，RV）属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus）。野生型RV是人畜共患的狂犬病的致病因子，在神经系统中具有传播属性，对人和动物均具有较高致病性。随着反向遗传学手段的成熟，经过改造的RV，可用于神经回路研究。RV感染中枢系统后，主要标记神经元，几乎不标记胶质细胞；被感染的神经元在一定时间内（7-12天）几乎不发生明显病变及裂解。Wickersham 等基于RV疫苗株Sad B-19感染性克隆构建的复制缺陷型重组RV具有较低的毒性和较高的安全性，可清晰的标记神经元的精细形态，并通过反向互补策略实现了对神经网络联接的逆向跨单级突触追踪。

RV逆行及跨单突触原理

RV的囊膜糖蛋白（glycoprotein，G）是其逆行跨突触所必需的蛋白，其受体大量分布在轴突末端，感染后可沿轴突逆行进入神经元胞体开启病毒复制，G蛋白缺失的RV（RV-ΔG）会丧失跨突触能力，而其复制及转录不受影响（可持续高丰度表达外源基因），因此，RV-ΔG携带报告基因后，其功能类似CTB，retrobeads等，可逆向高亮度标记神经元精细形态。另外，补偿RV-G蛋白，可辅助RV-ΔG逆行跨突触感染上一级神经元，从而实现跨单突触神经网络标记。

利用重组的禽类肉瘤病毒（Aviansarcoma-leukosisvirus，ASLV）的外膜蛋白（EnvA）融合蛋白包装RV形成的病毒粒子，可特异性识别EnvA的受体TVA（TVA只存在于禽类细胞中，在哺乳动物神经元中无表达）介导病毒特异性地感染细胞。利用Cre转基因鼠结合Cre-LoxP控制表达TVA及G蛋白的AAV辅助病毒，可实现只在特定区域特异类型神经元中表达TVA及G蛋白，从而利用RV-EnvA-ΔG实现对特异类型神经元的逆向跨单级突触标记（如图1）。

图1. A：跨单级RV改造原理； B：RV逆行跨单级突触标记示意图 （Arenkiel BR et al. Nature. 2009.）
 

滴度检测

病毒滴度单位为IFU/ mL（infectious units per mL），表示每毫升病毒能有效感染的靶细胞数目。病毒滴度采用梯度稀释法测定。

图2. RV样品制备细胞图（以RV-ΔG-dsred为例）

应用实例

适应的神经科学问题:

1) 特定单个区域特异类型神经元的全脑单级输入网络标记。

2) 两个区域特异类型神经元跨单级输入网络标记。

3) 三级连接网络的跨单突触标记。


应用举例

图3. RV-EnvA-ΔG-dsRed结合AAV helper实现神经元跨单突触标记，在两侧海马、丘脑背外侧核（LD）、丘脑前背侧核（AD）、丘脑室旁核（PVA）等脑区都能看到红色荧光蛋白标记的神经元
 

生物安全性

利用RV示踪工具病毒进行相关神经回路标记实验，对实验员的病毒使用经验及生物安全环境有较高要求。动物实验的流程及样本取材实验必须在生物安全二级（BSL-2）实验室中完成，并符合病毒操作相关规程。

参考文献：

[1]Ian R. Wickersham, Heather A. Sullivan & H. Sebastian Seung. Axonal and subcellular labelling using modifiedrabies viral vectors.Nature communications.,Mar,2013. 3332.
[2] Benjamin F. Fosque, Yi Sun, Hod Dana, et al. Labeling of active neural circuits in vivo with designedcalcium integrators. NEURAL CIRCUITS. FEBRUARY 2015. VOL 347 ISSUE 6223.
[3] Ian R. Wickersham1,3 and Heather A. Sullivan. Rabies Viral Vectors for Monosynaptic Tracing and TargetedTransgene Expression in Neurons. CSHprotocol. June ,2015.375-385.
[4] Shinya Ohara, Sho Sato, Kei Oyama, et al. Rabies Virus Vector Transgene Expression Level and Cytotoxicity Improvement Induced by Deletion of Glycoprotein Gene. PLOS ONE.November 2013. Issue 11 ,e80245.

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