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- 2025年07月16日
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- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
1×10^6 细胞数/ml
- 相关疾病：
见说明书
- 细胞形态：
见说明书
- 器官来源：
见说明书
- 运输方式：
复苏或冻存运输
- 年限：
P4代细胞
- 生长状态：
贴壁/悬浮
培养条件：DMEM+10% FBS；37℃，5% CO2
生长状态：贴壁
细胞培养步骤
一．培养基及培养冻存条件准备：
1） 准备培养基；北美胎牛血清，10%；双抗1%。
2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。 3） 冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。
二．细胞处理：
1） 复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。 对于贴壁细胞，传代可参考以下方法： 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
1. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
2. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
3. 将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。 细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。 下面T25瓶为例；
1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。
3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
注意事项：
1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 先不开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放在培养箱静置数小时（4h左右），稳定细胞状态，切忌在温箱内静置过夜。
3. 静置后镜检，拍照，记录细胞状态。建议传代后也拍照记录细胞生长情况。
4. 贴壁细胞：若细胞密度超过80%，可正常传代；若未超过80%，收集细胞瓶内的培养基，留8ml继续培养至80%左右再传代，瓶盖可稍微拧松。
5. 细胞瓶内的培养基含血清和双抗，可收集后4℃保存备用，可补加2%血清。刚开始传代时建议一半用细胞瓶内的培养基，一半用客户自备的培养基，使细胞逐渐适应培养条件，以免因不适应而造成生长状态不佳。
6. 细胞胰酶消化液建议使用PBS配制，
7. 因为细胞培养过程外因太多，所以我们的售后保障期为一周，超过一周的细胞我们会酌情处理，但不提供免费更换服务。 T细胞运输和保存：可选择干冰运输及发送复苏存活细胞方式：（1）干冰运输，收到后立即转入液氮冻存或直接复苏；存活细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。
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文献和实验的Lipofect2000细胞毒性的确较大，我们实验室也经常用此来转染HEPG2细胞，我做过实验对比，转染后换液与不换液的效果差不多，不知你用的是几孔板还是皿，我们一般12孔板用质粒1.6μg，LIPO20003.2μl，脂质体复合物与细胞作用的时间不宜过长，及时补足含血清的培基，其他可能的原因有：1.细胞状态要好，如果细胞状态不好对转染结果会有很大影响；2.转染前后不要加入抗生素；3.所使用的试剂如转染试剂、培基、血清是否有质量保证，或是是否在保质期内；4.如果转染前用了无血清培养使细胞同步化，因为无血清培养对细胞
的转染有比较好的条件的，敬请各位不吝赐教!谢谢! 花面交相映认为： Invitrogen 的Lipofect2000细胞毒性的确较大，我们实验室也经常用此来转染HEPG2细胞，我做过实验对比，转染后换液与不换液的效果差不多，不知你用的是几孔板还是皿，我们一般12孔板用质粒1.6μg，LIPO20003.2μl，脂质体复合物与细胞作用的时间不宜过长，及时补足含血清的培基，其他可能的原因有： 1.细胞状态要好，如果细胞状态不好对转染结果会有很大
ml 含 15%胎牛血清 DMEM 培养基 ,混匀后加入细胞培养板 ,每孔 1 ml，5%CO2温箱 37℃培养。唐孟萱等将上述方法与细胞专著所述方法相比较，传统 37 ℃水浴方法复苏后细胞存活率为 68.4%，先40℃溶解后37℃恒温方法复苏后细胞存活率为85.7%。证明其所用方法优于传统方法。1.2 复苏用培养基的选择钟志宏等使用培养基培养基RPMI-1640和DMEM两种培养基对HepG2细胞进行培养，结果发现，用DMEM培养基培养的细胞结果在接种密度为1×104/cm2、血清含量为15%时
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