- ¥800 - 1500
- 钦诚生物
- 上海
- QC6793
- 2025年07月12日
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- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
负20度
- 保质期：
2年
- 供应商：
钦诚生物
- 规格：
2UG/5UG
| 规格： | 2UG | 产品价格： | ¥800.0 |
|---|---|---|---|
| 规格： | 5UG | 产品价格： | ¥1500.0 |
基本信息
| 别名: | NM_001261057.1；BC022500.1（无突变）;ETL1； |
|---|---|
| 原核抗性: | 氨苄青霉素Amp |
| 筛选标记: | 无 |
| 克隆菌株: | 大肠杆菌DH5α |
| 培养条件: | LB培养基/37℃ |
质粒图谱
pBluescriptR-LGI1(7个同义突变)人源基因模板质粒使用说明：
1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl无菌水溶解质粒，室温放置1min；
2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态，置于冰盒上解冻，并做好标记；
3、取2μl质粒加至100μl感受态中，冰浴30min；
4、42℃热激90s，再冰浴2min；
5、加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；
6、6000rpm离心5min，仅留100ul上清混匀菌体沉淀；
7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上，倒入适量玻璃珠，涂匀液体；
8、将平板正向培养1h，再倒置培养12h~16h；
9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中，震荡培养12h~16h，根据实验需要提取质粒。
pBluescriptR-LGI1(7个同义突变)人源基因模板质粒注意事项：
1、如果您收到的是甘油菌种，请先四区划线，挑取单克隆培养。
2、如果第二天转化平板长的过多，请将质粒按比例稀释后再转化。
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文献和实验没有同步改变 PAM 或 seed 区序列，HDR 成功后新生成的等位基因依然能被 Cas9 识别并再次切开。反复切—修—切的结果是：好不容易修复正确的克隆被切坏，最终留下来的反而是 indel 克隆。 对策：在供体模板上对 PAM 或 seed 区引入同义突变（不改变氨基酸序列），使修复后的位点无法被再次识别。这是敲入设计里的标准动作，也是最容易被漏掉的一步。 障碍 2：供体模板的随机整合 质粒供体（尤其是带抗性基因的）会随机整合到基因组其他位置。用抗性筛选后长出来的克隆，很大一部分是随机
组敲除筛选。点突变项目若在前期需要确认靶点是否为必需基因，文库筛选是高效的预判手段。 CRISPR-Pool SAM 文库：激活筛选文库，可作为点突变表型的反向验证手段。 稳定细胞株构建服务 点突变细胞株构建包含：突变类型评估与路线选择（碱基编辑 / 先导编辑 / HDR）、gRNA 与供体模板设计（含防再切割同义突变）、递送方案优化、PCR-RFLP 或 ddPCR 初筛、单克隆筛选与扩增子 NGS 确认，最终交付细胞株及完整基因型与功能验证报告。 --- 五、常见问题FAQ 碱基编辑的窗口位置
"把基因表达量调高"听起来是个简单需求，但用 CRISPRa 和用 cDNA 过表达质粒，得到的细胞模型和结论都可能完全不同。选错的话，表型实验从一开始就偏了。 先说结论：过表达质粒是在细胞质里额外生产一份蛋白，表达量远高于生理水平、不考虑 isoform 和调控背景、也无法保证定位正确；CRISPRa 是在内源基因组位点上激活转录，产物是天然的剪接 isoform、受内源调控元件约束、表达量更接近生理范围。想问"这个基因多了会怎样"用过表达，想问"把这个基因的内源表达调高
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