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- 哺乳动物CRISPR（单gRNA）表达质粒载体
- 广州
- 2026年01月31日
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云舟生物科技（广州）股份有限公司
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提供定制载体
概述
CRISPR/Cas9（规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白9）核酸酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一（另外两种是ZFN和TALEN），可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。这些质粒载体编码的特异性RNA，能够引导DNA核酸酶（或缺刻酶）编辑基因组中特定位点的DNA序列。
Cas9是RNA引导DNA核酸酶，是天然原核免疫系统的一部分，赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。为了方便使用，我们设计的CRISPR/Cas9载体能够在一个载体上同时有效表达Cas9核酸酶（或缺刻酶）和引导RNA（gRNA）。
我们的CRISPR/Cas9表达载体中有两种Cas9核酸酶供选择，一种是标准的人源化Cas9（hCas9），能够有效地在靶位点产生双链断裂（DSBs）；另一种是“缺刻酶”（Cas9_D10A），仅在DNA中产生单链切割。如果将Cas9_D10A缺刻酶与靶向两条互补链的两个gRNA一起使用，缺刻酶会在两条链上产生单链切割，从而导致靶位点处产生DSB。这种方法通常会减少CRISPR/Cas9脱靶效应，因为它需要两个gRNA同时靶向靶位点。
细胞通过非同源末端连接途径（NHEJ）修复通常会产生小的片段或碱基缺失，插入和碱基置换等突变。当这些突变破坏蛋白质编码区（例如引起移码缺失）时，会引起功能性基因敲除。在少数情况下，CRISPR/Cas9载体和外源供体DNA模板共同导入细胞时，细胞会通过同源性修复（HDR）机制来修复DSB，靶基因DNA序列会被模板序列取代，碱基发生改变，如点突变等。缺刻基因组DNA也会经常发生同源修复（HDR），如将外源模板DNA与Cas9_D10A缺刻酶一起导入细胞中，有可能产生碱基改变。
利用CRISPR/Cas9系统可以有效靶向大部分DNA序列，而NGG（有时是NAG）是必须的。NGG叫做前间区序列邻近基序（PAM），位于靶DNA，gRNA识别序列的3'末端。
我们的CRISPR/Cas9表达载体可以用于快速高效靶向细胞基因组，并在靶位点并产生碱基缺失等突变。为了在特定的靶位点引入突变，需要与靶DNA序列匹配的gRNA序列以及核酸酶hCas9（产生DSB）或其变体Cas9_D10A缺刻酶（单链切割）。
图1 all-in-one CRISPR系统介导的基因编辑。（A）向稳定表达EGFP的HEK293T细胞（HEK293T-EGFP）转染表达Cas9:T2A:mCherry的常规质粒和靶向EGFP的scramble gRNA。转染后72小时，流式细胞术检测EGFP表达水平。MFI表示荧光强度中值。（B）显微镜（100x）观察EGFP和mCherry表达。（C）转染all-in-one CRISPR载体的细胞对比无转染细胞中的相对EGFP表达。相对EGFP表达量用以下公式计算：[MFI (experimental group) – MFI (WT HEK293T cells)] / [MFI (HEK293T-EGFP cells) – MFI (WT HEK293T cells)]。Mean±SD，ns P>0.05，ANOVA以及Tukey事后检验。（D）gRNA靶向的基因组DNA区域使用PCR进行扩增，基因编辑效果使用T7E1试验确认。
瞬时表达：转染CRISPR/Cas9质粒载体后，Cas9蛋白和gRNA会在靶细胞中大量瞬时表达。如果没有药物筛选，质粒会随着时间流逝而丢失，在基因组编辑发生后，靶细胞中的Cas9和gRNA也会逐渐消失。
简单易懂：gRNA和靶位点之间的简单同源关系使得CRISPR/Cas9系统简单且易于设计。
不足之处
具有脱靶效应：已有文献报道CRISPR/Cas9具有脱靶效应，通常TALEN系统比CRISPR/Cas9具有更低的脱靶活性。通过将Cas9_D10A缺刻酶与两种gRNA结合使用（如上所述），可以显著减轻脱靶效应。
PAM要求：CRISPR/Cas9靶位点必须包含NGG序列（使用较多），也叫做PAM序列，位于gRNA识别序列3'末端。
载体关键元件
Single-gRNA CRISPR regular plasmid vector
U6 Promoter: This drives high level expression of the gRNA. This is the promoter of the human U6 snRNA gene, an RNA polymerase III promoter which efficiently expresses short RNAs.
gRNA: Guide RNA compatible with Cas9 derived from Streptococcus pyogenes.
Terminator: Terminates transcription of the gRNA.
CBh promoter: Chicken beta-actin promoter. Drives expression of the downstream Cas9 nuclease.
Cas protein: Cas9 nuclease variant chosen by user.
BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.
CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.
SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.
pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.
Dual-gRNA CRISPR regular plasmid vector
U6 Promoter: This drives high level expression of the gRNA. This is the promoter of the human U6 snRNA gene, an RNA polymerase III promoter which efficiently expresses short RNAs.
gRNA #1: The first guide RNA compatible with Cas9 derived from Streptococcus pyogenes.
gRNA #2: The second guide RNA compatible with Cas9 derived from Streptococcus pyogenes.
Terminator: Terminates transcription of the gRNA.
CBh promoter: Chicken beta-actin promoter. Drives expression of the downstream Cas9 nuclease.
Cas protein: Cas9 nuclease variant chosen by user.
BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.
CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.
SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.
Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.
pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.
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