microRNA整套技术服务（靶基因功能验证服务，报告基因载

microRNA靶基因验证实验　

当前，microRNA对靶基因的功能研究十分热门。利用荧光素酶报告基因检测实验寻找或验证microRNA对靶点作用性是不可或缺的实验技术。英拜生物可为您提供microRNA报告基因载体构建服务，并可进一步为您提供荧光素酶报告基因检测实验服务。您只需要提供目的microRNA靶位点序列，本公司专业技术服务人员就可替您完成载体构建，为您节省大量的时间和精力。
下图为microRNA-reporter载体表达框架示意图，具有多克隆位点，方便插入目的靶点序列。psiCHECK-2载体用于终点法的细胞裂解物检测，包含萤火虫荧光素酶基因，使海肾荧光素酶的表达水平归一化，令该系统更可靠、重现性更好。使用psiCHECK-2载体时，无须通过共转染进行归一化。

英拜生物microRNA报告基因实验流程：

1. microRNA靶点的预测

利用Targetscan,miRanda,PicTar软件得到目的microRNA的预测靶点序列(客户提供)。

1. 获得microRNA靶点序列

根据提供的靶序列，合成两条互补的单链DNA模板。或者，设计引物PCR扩增目的microRNA靶基因3’UTR序列。

1. microRNA靶序列克隆

将合成的两条单链退火成双链（具有粘性末端），或将PCR产物双酶切，后连入经过同样双酶切的miR-reporter载体中，连接产物转化大肠杆菌DH5α。

1. 阳性克隆鉴定。

挑选转化的菌落，PCR筛选含有插入片段的阳性克隆，测序验证克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。

1. 细胞转染准备

将含目的microRNA靶基因的报告基因载体、内参质粒和microRNA　mimics或microRNA negative control共转染293T或Hela细胞。

1. 荧光素酶检测

共转染细胞24-72h后，进行双荧光素酶检测，确定目的microRNA的靶基因。

1. 突变实验

构建miR-reporter载体（含突变靶位点的荧光素酶报告基因载体）与内参质粒、microRNA　mimics或microRNA negative control共转染293T或Hela细胞。共转染细胞24-72h后，进行双荧光素酶检测，进一步验确定目的microRNA的靶基因。

1. 整理分析数据，得出结论。

提供有microRNA靶序列的报告质粒，以及内参和对照质粒各一份。甘油保存菌株各一支。附mir-reporter载体的说明书，以及实验报告，包括载体构建过程，鉴定记录，测序报告，细胞转染，荧光检测。



注：
microRNA　mimics与microRNA negative control由客户提供或由本公司代购（Dharmacon公司),也选用Pre-miR 与Pre-miR negative control（Ambion）或构建microRNA过表达载体及对照载体（本公司可以构建）。

MicroRNA功能学实验

• 细胞增殖试验
• 细胞凋亡试验
• 细胞周期试验
• 细胞侵袭试验
• 细胞迁移试验

服务流程：

构建过表达microRNA载体以及对照载体或客户提供人工合成寡核苷酸→转染细胞系→qRT-PCR检测目的MicroRNA前体的表达情况→分析目的MicroRNA与细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞侵袭、细胞迁移之间的调控关系→出具书面报告，qRT-PCR分析的原始数据

客户提供：

MicroRNA前体（Ambion公司）或mimic 与寡核苷酸（即对照前体或control mimic）及细胞系。

公司提供：

MicroRNA表达载体的质粒、质粒测序图、qRT-PCR分析的原始数据、结果分析的书面报告。

miRNA表达检测

定量检测组织或细胞样本中的miRNA是功能研究的第一步，有助于人们进一步了解 miRNA与疾病发生及发展的关系，以便为疾病的早期诊断提供新的思路。本公司主要通过microRNA芯片、microRNA-Seq、microRNA PCR 芯片、实时定量PCR、原位杂交等多种方法检测miRNA的表达情况。为您提供最优质的、全方位的技术服务。

1、microRNA芯片检测服务 http://www.biomart.cn/infosupply/7484330.htm

2、 microRNA PCR芯片检测服务 http://www.biomart.cn/infosupply/10966567.htm

3、microRNA-Seq检测服务http://www.biomart.cn/infosupply/9632788.htm

4、microRNA定量PCR http://www.biomart.cn/infosupply/7484332.htm

miRNA芯片，microRNA-Seq数据深度发掘分析

a) 芯片，测序数据聚类分析

b) microRNA靶基因预测“TargetScanS”， “miRanda (miRBase)”，“miRGen”等数据库

预测差异microRNA的所有靶基因。

c) 靶基因GO分析

根据Gene Ontology数据库对靶基因进行功能显著分析，从而筛选显著性功能的靶基因。

d) 靶基因pathway分析

根据KEGG数据库对靶基因进行Pathway分类，并进行显著性分析从而得到显著性的Pathway分类。

e) 构建的MicroRNA与基因的调控网络

通过构建MicroRNA与基因的调控网络，可以从中找出hub基因及hub microRNA.

f) microRNA 、靶基因、转录因子调控网络

microRNA也会受到转录因子调控造成表达差异，通过系统研究转录因子与基因间的调控关系，可以为寻找重要转录因子及重要基因提供线索。

g) microRNA启动子分析及甲基化位点分析

当microRNA研究日趋火热，越来越多的研究者开始关注microRNA本身甲基化变化。MicroRNA基因的甲基化变化也是造成microRNA表达差异的重要原因。