NP-40裂解液

NP-40 Lysis Buffer主要由Tris-HCl、NaCl、NP-40以及sodium pyropho-sphate，β-glycerophosphate，sodium fluoride, EDTA等多种蛋白酶抑制剂组成。用NP-40 Lysis Buffer得到的蛋白，可以用BCA蛋白定量试剂盒和Bradford蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，如Triton、SDS、NP-40等。NP-40裂解液 (NP-40 Lysis Buffer)是采用一种温和的裂解方法获得总蛋白的裂解液。所获得的蛋白质可以用于PAGE电泳、Western、免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。

操作步骤(仅供参考)：
(一)贴壁培养细胞
取NP-40 Lysis Buffer 置于室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。
去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例，加入NP-40 Lysis Buffer 。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或4℃裂解15～30min，通常裂解液作用于细胞1～3s内，细胞就会被裂解。
10000～12000g，4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)悬浮培养细胞
取NP-40 Lysis Buffer 置于室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入150～200μl含有PMSF的裂解液的比例，加入NP-40 Lysis Buffer 。通常6孔板每孔细胞加入150μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200～250μl。再用手指轻弹以充分裂解细胞，充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
10000～12000g，4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三)组织样本
取NP-40 Lysis Buffer 置于室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。把组织剪切成细小的碎片，越小越。
取在液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解30～60min。
步骤3、4亦可以采用如下过程：按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例，加入含有PMSF的NP-40 Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，该过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
10000～12000g，4℃离心5～15min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
 
注意事项：
在贴壁培养细胞的操作步骤中，去除贴壁细胞的培养液后，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。
如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
在培养细胞的裂解中，如果细胞量较多，必需分装成50～100万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。
如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈Vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
溶解NP-40 Lysis Buffer时，应尽量缩短溶解时间，避免裂解液中的有效成分失效。
细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或4℃进行。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。