细胞凋亡检测试剂盒Ⅱ(AP)

特别提示：包括细胞凋亡检测试剂盒Ⅱ(AP)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：细胞凋亡检测试剂盒Ⅱ(AP)
产品货号：ZN1530
产品规格：20T

保存条件：-20℃冰冻保存。
保存期：一年
工作原理：
在机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统上用显微镜来观察细胞的死亡，其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚，时间也很短暂。凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA 被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的3’-OH 末端。末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase)可以将Digoxin标记的dUTP(DIG-dUTP)标记至3’-OH 末端，DIG-dUTP 结合在DNA断点部位，可以通过生物素化抗Digoxin抗体(Anti-DIG-Biotin)和 SABC-AP反应后，加入显色底物 BCIP/NBT予以显示。凋亡的细胞核呈紫蓝色，从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。
试剂盒内容：
1.标记缓冲液(Labeling Buffer)1ml
2.末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT,×20)20μl
3.DIG-dUTP(×20)20μl
4.封闭液(Blocking Reagent)4ml
5.生物素化抗Digoxin抗体(×100)20μl
6..SABC-AP(×100)20μl
7.Proteinase K(×200)50μl
8.BCIP/NBT 显色剂(×20)0.2ml
9.抗体稀释液4ml
阳性对照片2张
用户自备试剂：
1.多聚赖氨酸或APES。
2.0．01M TBS(pH7.5)(配法:1L 双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2 克Tris和0.45—0.5ml纯乙酸)。
3.0.01M TBS(pH9.0--9.5)(配法:1L 双蒸馏水中加入 8.5克氯化钠,1.2克Tris)。
4.核固红—复染用。
5.水溶性封片剂。
操作步骤：
1.样品处理
(1)玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理。
(2)细胞涂片和冰冻切片：zuì重要的是及时固定。用 4%*聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0---7.6)室温下固定 30—60分钟。PBS洗2分钟×2次。蒸馏水洗涤 2分钟×2次。
(3)组织：应及时固定。常规 4%*聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0---7.6)或10%中性缓冲福尔马林固定 4 小时以上，石蜡包埋。切片常规脱蜡入水(脱蜡务必干净)。
2.标本片加 0．01M TBS(pH7.5)1：200 新鲜稀释 Proteinase K 37℃消化 1—15分钟,TBS洗2分钟×3次。(细胞涂片和冰冻切片一般不消化或仅消化 10—60 秒钟。新鲜石蜡切片消化 5-10分钟。陈旧石蜡切片消化 10-15分钟)。
3.标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer),20μl/片,以保持切片湿润。然后按每张切片取 TdT和 DIG-d-UTP 各1μl，加入18μl标记缓冲液中，混匀，甩去切片上多余液体后加混合的标记液，20μl/片。置样品于湿盒中，37℃标记2 小时。
4.0．01M TBS(pH7.5)洗2分钟×3次。
5.加封闭液 50μl/片，室温 30分钟，甩掉封闭液，不洗。
6.用抗体稀释液 1：100 稀释生物素化抗Digoxin抗体：(取1ml抗体稀释液加生物素化抗Digoxin抗体 10μl)，混匀后 50μl/片加至标本片上。置样品于湿盒中，37℃反应 30-60分钟。0.01M TBS(pH7.5)洗2分钟×3次。
7.用抗体稀释液 1：100 稀释 SABC-AP：取1ml抗体稀释液加 SABC-AP 10μl，混匀后50μl/片加至切片。37℃反应 60分钟。0.01M TBS(pH7.5)洗5分钟×4次。
8.BCIP/NBT 显色：BCIP/NBT(×20)按 1：20的比例用 0.01M TBS(pH9.0-9.5)稀释，混匀。显色液加至标本上。避光显色 20-30分钟，若无背景出现则可继续显色。充分水洗。
9.必要时可用核固红等复染。水溶性封片剂封片，也可简单地用甘油封片。
镜检。
结果判定：
细胞核中有紫蓝色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。
注意事项：
1.试剂盒严格-20℃存放。
2.初用时如试管底部无可见的试剂，在离心机离心 3分钟，使试剂沉至管底。
3.检测过程中切勿使样品干涸。
4.BCIP/NBT 显色较慢，可适当延长显色时间。

除了细胞凋亡检测试剂盒Ⅱ(AP),，我公司还供应以下相关产品：



名称：细胞凋亡阳性对照试剂盒
货号：YT119
规格：200次
本试剂盒含有两种不同的细胞凋亡诱导试剂，试剂A和试剂B。细胞凋亡诱导试剂A(Apopida)和试剂B(Apobid)分别可以诱导Hela、HEK293、CHO、COS等常见细胞的细胞凋亡。

由于细胞凋亡的诱导具有细胞特异性，细胞凋亡的机制也具有一定的细胞特异性，尽管细胞凋亡诱导试剂A和试剂B可以诱导常见的一些细胞的细胞凋亡，但是我们无法保证这两种试剂可以诱导任何一种细胞发生凋亡。细胞凋亡诱导试剂A和试剂B相互补充，可以诱导更多种类的细胞产生凋亡。本试剂盒至少可用于检测200个样品。

试剂盒组份：

细胞凋亡诱导试剂A——————200μl
细胞凋亡诱导试剂B——————200μl

注意事项：对于不同的细胞，需要摸索细胞凋亡诱导试剂的不同浓度和诱导时间。

储存条件：-20℃，有效期一年。

名称：线粒体提取试剂盒
货号：SNM527
规格：50T

名称：Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒
货号：KFS187
规格：10T|20T|50T|100T
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V 进行荧光素PE 标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。

注意事项
1. 微量试剂取用前请离心集液。
2. Annexin V-PE 避光保存及使用。
3. 本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低于1×105，不推荐用于检测组织样本。
4. 推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，建议适用不含EDTA 的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA 的PBS 中，防止进一步的损伤。
5. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
6. 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

名称：细胞膜红色荧光探针
货号：SY0494
规格：10mg
DiI是一种亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构，进入细胞膜后，DiI在整个细胞膜上扩散，zuì佳浓度时可以使整个细胞膜染色。DiI在进入细胞膜之前荧光非常弱，当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强，DiI被激发后可以发出橙红色的荧光，具有很高的淬灭常数，中等强度的光量子和很短的激发态寿命。可以用标准的TRITC滤光片检测。

DiI通常不会明显影响细胞的生存力，因此被广泛用于正向或逆向的，活的或固定的神经等细胞或组织的示踪剂或长期示踪剂（long-term tracer）。除了zuì简单的细胞膜荧光标记外，还可以用于检测细胞的融合和粘附，检测发育或移植过程中细胞迁移，通过FRAP（Fluorescence Recovery After Photobleaching）检测脂在细胞膜上的扩散，检测细胞毒性和标记脂蛋白等。

CAS：41085-99-8
分子式：C59H97ClN2O4
分子量：933.87
外观：红色至暗红色，紫色至深紫色粉末
Ex/Em：550/567 nm
推荐滤光器：XF32-Omega, 31002-Chroma
纯度：≥98%（TLC）
溶解性：溶于DMF，DMSO，*醇
储存条件：4℃避光,有效期一年
结构式：


使用方法

1. 染色液制备
（1）配置DMSO或EtOH 储存液：储存液用 DMSO或EtOH配置浓度1～5 mM。
【注】未使用的储存液分装储存在-20℃，避免反复冻融。
（2）工作液制备：用合适的缓冲液（如：无血清培养基，HBSS或PBS）稀释储存液，配制浓度为1～5 μM的工作液。
【注】工作液zuì终浓度建议根据不同细胞系和实验体系来优化。

2. 悬浮细胞染色
（1）加入适当体积的染色工作液重悬细胞，使其密度为1×106/mL。
（2）37 ℃孵育细胞 2～20min，不同的细胞zuì佳培养时间不同。可以20min作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。
（3）孵育结束，按1000～1500 rpm离心5min。
（4）倾倒上清液，再次缓慢加入37℃预热的生长培养液重悬细胞。
（5）重复（3），（4）步骤两次以上。

3. 贴壁细胞的染色
（1）将贴壁细胞培养于无菌盖玻片上。
（2）从培养基中移走盖玻片，吸走过量培养液，将盖玻片放在潮湿的环境中。
（3）在盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。
（4）37 ℃孵育细胞 2～20min，不同的细胞zuì佳培养时间不同。可以20min作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。
（5）吸干染料工作液，用培养液洗盖玻片2～3次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，孵育5～10min，然后吸干培养基。

4. 显微镜检测
（1）DiD，DiO，DiI，DiR和DiS滤光器的选择参见表1。
（2）多色染料的同时检测，滤光器按照以下设定：
a) DiI和DiO＝Omega XF52，Chroma 51004；
b) DiI和DiD＝Omega XF92，Chroma 51007；
c) DiI，DiO和DiD＝Omega XF93，Chroma 61005

5. 流式细胞仪检测
经DiO，DiI，DiD和DiR染色的细胞可分别用流式细胞仪的FL1，FL2，FL3或FL4通道检测。