用HABA法计算蛋白质的生物素标记率
1. 原理
生物素对蛋白质的标记率采用HABA(4-Hydroxy-azobenzene-2’-carboxylic acid)的方法计算。
HABA和亲和素结合后在500 nm会有吸收。由于生物素-亲和素的亲和性比HABA-亲和素的高,所以在HABA-亲和素溶液中加入生物素标记蛋白,生物素会取代HABA和亲和素结合。因为HABA和亲和素解离会导致在500 nm的吸光度减少,故利用此原理可以计算生物素的标记率。
2. 试剂
• 亲和素 :10 mg
• HABA : 14 mg
• DMSO :500 μl
• PBS buffer(pH 7.4):20 ml
8.0 g/l NaCl,0.2 g/l KCl,1.15 g/l Na2HPO4,0.2 g/l KH2PO4
3. 测定及计算方法
1) 在2 ml样品管中精确称量14.0 mg HABA后,用移液器加入500 μl DMSO溶解制成HABA溶液。
2) 在20 ml容量瓶中精确称量10.0(±0.1) mg 亲和素后,加入15 ml PBS溶解。然后用移液器加入200 μl上述配制好的HABA溶液后,补充PBS至20 ml,充分混合,制成HABA-亲和素溶液。
3) 用移液器吸取900 μl配制好的HABA-亲和素溶液至微型比色槽( 容量1 ml,长1 cm)中,测定在500 nm的吸光度,重复测定3次的平均值作为AbsA,这时的AbsA值大约为1.5。
4) 用移液器吸取900 μl配制好的HABA-亲和素溶液至2 ml样品管中,然后加入100 μl纯化的标记蛋白质溶液,旋紧盖子后,用Vortex混匀。
5) 静置5 min(以上),用移液器转移至微型比色槽中,测定在500 nm的吸光度,作为AbsB。如果蛋白质浓度过高,会造成生物素比亲和素多,有时会出现无法计算出和蛋白质结合的准确生物素数量的情况。所以如果AbsB<0.7,建议先适当稀释蛋白质溶液(稀释倍率:Z),然后加入HABA-亲和素溶液,计算出标记率。
6) 按照以下公式计算出样品中的生物素浓度B(mol/l)。
B(mol/l)=Z×[10-2×(0.9×AbsA-AbsB)/34]
7) 也可以计算出1个分子蛋白质上结合的生物素数量。例如按照Ⅳ.用Biotinylation Kit(Sulfo-OSu)中的生物素标记方法,标记X g分子量为MWprotein的蛋白质,纯化后的蛋白质浓度A(mol/l)可以表示如下:
A(mol/l)=(X/MWprotein) ×103
在1个分子蛋白质上结合的生物素数量(mol/mol)=B/A。
1.能够用这个试剂盒标记其他蛋白质吗?
2.标记蛋白之前是否必须使用过滤管?
如果蛋白溶液中不含有带有氨基的小分子且蛋白浓度在10 mg/ml或者70 μM左右时,可以不使用过滤管来过滤,只需要将10 μl 样品溶液和90 μl Reaction Buffer混合,将混合液加入到NH2-reactive biotin管中。反应后,将反应液移入过滤管中,并从步骤6开始按照操作说明上的方法做后续试验。
3.是否必须要用WS buffer来储存标记产物?
不一定要使用WS buffer,可以使用任何适合该实验的缓冲液。
4.我的样品溶液中含有小的不溶物,应该怎么办?
5.标记产物能保存多久?
在0-5℃下能够保存2个月。如果需要保存更久,可以添加等量的丙三醇,并在-20℃下(只要该蛋白可以冷冻)存放。但是,还要注意样品自身是否稳定。
6.用该试剂盒所能标记的IgG的最小量是多少?
IgG的最小量为10 μg。10 μg-100 μg的IgG的标记比率是一样的。
蛋白质标记试剂可用于各种与抗原-抗体反应相偶合的各种检定。其中,荧光素、生物素以及酶标记试剂是常用的几种抗体标记试剂。多数蛋白质标记试剂具有相似的反应位点,例如用于氨基的琥珀酰亚胺酯(NHS)以及用于巯基的马来酰亚胺或溴乙酰胺。Dojindo提供以下用于蛋白质研究及蛋白质组学的蛋白质标记试剂和试剂盒。
|
官能基 |
品名 |
检出 |
λex |
λem |
蛋白质抗体标记试剂盒 |
氨基or巯基 |
Alkaline Phosphatase Labeling Kit-NH2,-SH |
基质 |
- |
- |
Peroxidase Labeling Kit-NH2,-SH |
基质 |
- |
- |
Biotin Labeling Kit- NH2,-SH |
基质 |
- |
- |
Fluorescein Labeling Kit-NH2 |
荧光 |
500 |
525 |
HiLyte FluorTM555 Labeling Kit-NH2 |
荧光 |
555 |
570 |
HiLyte FluorTM647 Labeling Kit-NH2 |
荧光 |
655 |
670 |
HiLyte FluorTM750 Labeling Kit-NH2 |
荧光 |
760 |
780 |
Allophycocyanin Labeling Kit-NH2,-SH |
荧光 |
650 |
660 |
R- Phycoerythrin Labeling Kit-NH2,-SH |
荧光 |
564 |
575 |