一站式TA克隆试剂盒

特别提示：包括一站式TA克隆试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：一站式TA克隆试剂盒
英文名称：One-Stop TA Cloning Kit(A)

产品货号：一站式TA克隆试剂盒
产品规格：20次

TA克隆就是利用T载体两个3′端各带有一个T突出，而PCR扩增产物两个3′端各带有一个A突出的特点，在DNA连接酶的作用下，将PCR产物克隆到T载体中的过程，它是克隆PCR扩增产物的主要手段。

产品特点：
1.一站式，用户只需要准备PCR产物即可进行TA克隆。
2. T载体由Xcm I酶切方法制备，两个5′端100%含T突出，自连率几乎为零。
3. 克隆效率高，一次TA克隆实验一般能得到上百个重组子。
4. 阳性率高，一般能到90%以上，大大缩短了筛选工作。
5. 提供供两次实验用的对照插入片段，方便分析实验数据。
6. 插入位点两侧有对称的常见酶切位点(如EcoR I)，便于对克隆的PCR片段进行近一步的分析。
7. 克隆位点两侧分别有T3和T7 RNA聚合酶启动子，便于用克隆的PCR片段制备RNA探针。
8.可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。
9. T克隆位点位于β-半乳糖苷酶的α-肽编码区内，可以进行蓝白斑筛选。
10.含有丝状噬菌体f1 复制起始子，可以制备单链DNA。
 

成分	规格
即用型蓝白T载体(50ng/μL)	20μl
对照插入片段(50ng/μL)	5μl
T4快速连接缓冲液，2×	100μl
T4 DNA连接酶(5U/μL)	30μl
超纯水	1ml
高效感受态细胞	100μL×10只(只B型有)
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。感受态细胞需要干冰运输，-70℃保存，有效期6个月。

自备试剂：插入片段。

使用方法：

一：PCR产物的纯化和定量注意事项
1. 由于PCR体系中有大量会抑制DNA连接反应的dATP、还有一些可能在电泳胶上不一定会显示出来的非特异性扩增产物和引物二聚体，所以PCR产物必须用胶回收方法制备才能用于本试剂盒的连接。可以分别使用本公司柱式DNArc(BTN60202)和PAGE DNArc(包括柱式PAGE DNArc)从琼脂糖胶和PAGE胶上纯化回收PCR片段。具体操作见相关产品使用手册。
2. 琼脂糖胶回收的电泳缓冲液最好不要使用TBE缓冲液，因为它会影响DNA的胶回收效率。
3. 为避免UV对DNA的伤害，切胶最好在日光下进行(使用百奥莱博的绿如蓝染料的话，可以直接在黑色背景下看见DNA条带，不需要紫外光)。如果使用EB或其他染料，必须在紫外下切胶时，最好选择长波(360nm)紫外灯并以最快速度切胶，文献报道短波UV(300nm和240nm)会使DNA连接效率降低400多倍。使用短波UV时，可以使用百奥莱博的DNA防护剂UV Scavenger(BTN60601)减少伤害。
4. PCR片段的体积越小越便于后续操作。洗脱PCR片段时，用最少量的洗脱液洗脱。
 本试剂盒要求PCR回收片段的浓度最好为50ng/μL。如果浓度不够，最好用醇沉淀法沉淀后直接在管内设置连接反应，也可以使用本公司的核酸浓缩剂(BTN110801)直接浓缩。
5. 为准确定量回收的PCR产物同时又节约样品，最好使用微量分光光度计(只需用1μL样品测量)。如果分光光度计需要大量样品，建议使用电泳法定量：将回收的PCR片段与浓度已知的DNA Marker在含EB或绿如蓝染料的琼脂糖凝胶中电泳，通过比较DNA条带的相对荧光强度而估测PCR产物的浓度。

二：连接反应
1. 短暂离心装有蓝白T载体、连接缓冲液和T4连接酶的离心管。
2.在三个离心管中加入下列成分(注意，对照可以不做，在出现问题时再做)：

成份	样品管	阳性对照管	自连对照管
T4快速连接缓冲液，2×	5μl	5μl	5μl
蓝白T载体(50 ng/μL)(=0.03 pmol/μL)	1μl	1μl	1μl
自备PCR 纯化产物(0.03-0.1 pmol/μL)	Xμl(见注)	不加	不加
对照插入片段(50ng/μL)(=0.06 pmol/μL)	不加	1.5μl	不加
T4 DNA连接酶(5U/μL)	1-1.5μL	1-1.5μL	1-1.5μL
超纯水	补到10μL	补到10μL	补到10μL

注: 如何根据T载体的用量计算PCR纯化片段的最佳用量？
第一：确定插入片段与载体的最佳摩尔比，在本产品的T载体的长度固定(3Kb)时，最佳摩尔比跟插入片段的长度关系如下：

插入片段长度	与载体的摩尔比
1Kb以下	2:1或3:1
跟T载体接近(±1Kb)	1:1
比T载体长1Kb或更多	1:2或1:3

第二：根据选定的最佳摩尔比按下面方程式计算用量：

本产品提供的T载体长度为3 Kb，推荐用量为50ng，如果PCR片段长度为0.5 Kb，最佳摩尔比设定为3:1，则其用量为:

3. 用移液器吹打连接反应液使之混匀，然后放置在16℃孵育30分钟-过夜。
4. 65℃5分钟灭活连接酶后直接用于转化或-20℃保存。

三：细菌转化及筛选(仅供参考，本产品不提供相关试剂)
1. 将100μl转化效率在1×108 cfu/μg以上的感受态细胞于冰上解冻。
2. 取5-10μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。
3.在冰上放置30分钟。
4. 将离心管放42℃热休克90秒，然后快速将其转移到冰浴中放置1～2分钟。
5. 每管中加900μl LB培养基，37℃振荡培养1小时复苏细胞。
6. 将100μL复苏涂布到含Amp的LB琼脂平板上(也可加上X-gal和IPTG)。
7.室温4,000rpm离心剩余的900μl复苏细胞5分钟，弃去800μl上清，用剩余100μL培养基重悬细胞并涂布到含Amp的LB琼脂平板上(可加X-gal、IPTG)。
8. 将平板置于室温直至液体被吸收。此步非常重要，否则培养板将在37℃排除水分，细菌将随水在培养基上到处游动，不能形成单个菌落。
9. 倒置平皿，于37℃培养，12～16小时后可出现菌落。一般情况下阳性对照组总共会有上千个菌落(100μl转化液产生的菌落数×10)，自联对照只有少数几个菌落，样品组的菌落数取决于PCR回收片段的质量。
10. 按常规方法筛选重组子。

MCS位点：


除了一站式TA克隆试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：λDNA(不含N6-甲基腺嘌呤)
货号：BTN90407B
规格：5μg
本产品Lambda DNA(λDNA)为λ噬菌体中的DNA，是一种常见的DNA底物，分子量为31.5×106Da/48502bp，浓度为200～500μg/ml。A型为普通Lambda DNA。B型为不含N6-甲基腺嘌呤Lambda DNA。C型为非甲基化的cl857 Sam7 λDNA，是从感染的大肠杆菌GM119菌株中分离得到的。该菌株缺乏dam及dcm甲基化酶活性。非甲基化的λDNA以作为对DNA甲基化敏感的限制性酶的底物。

储存溶液：Tris-HCl(pH8.0)10mM；EDTA 1mM

储存条件：低温运输、-20℃保存、有效期一年。

纯度：
1. OD260nm/280nm＞1.8。
2. 琼脂糖凝胶电泳出现清晰单一条带。
3. 1μg的λDNA在Hind III酶切Buffer中37℃保温16小时后，琼脂糖凝胶电泳时出现清晰单一条带。
4. 1g的λDNA 用Hind III酶切(37℃，2小时)后，在琼脂糖凝胶电泳时出现8条清晰的DNA电泳带。

名称：酵母质粒小量抽提试剂盒
货号：YT004
规格：50次
本试剂盒是一种使用破壁酶消化去除酵母细胞壁，然后采用一种新型的酵母质粒纯化柱实现从酵母细胞中进行小量质粒快速抽提的试剂盒。无需酚氯*抽提，无需酒精沉淀，12个样品只需约1-1.5小时即可完成。

本试剂盒提供了破壁酶，酵母收集后，加入Lyticase消化去除细胞壁，接着采用传统碱裂法裂解细胞，然后将获得的上清液转移至结合柱结合DNA，经过离心快速洗涤，最后用洗脱液洗脱出酵母质粒DNA。由于采用了高浓度的破壁酶，无需再使用玻璃珠，可以避免因为玻璃珠的机械作用带来的酵母基因组DNA污染。

每个质粒纯化柱可以结合的质粒量的上限约为20微克。质粒DNA的产量依赖于酵母携带质粒的拷贝数，酵母菌株以及生长条件。通常酵母质粒的拷贝数较低，1.5-5ml培养过夜的酵母抽提获得的质粒DNA量约为1-3微克左右。高拷贝酵母质粒抽提时的得率会大大提高。抽提所得质粒的量与酵母培养浓度、质粒拷贝数、酵母品系等因素有关。

使用本试剂盒抽提得到的酵母质粒DNA可用于各种常规分子生物学实验，如转化、PCR、基于PCR的突变、体外转录、酶切、测序、文库筛选等。

产品组份：
酶解缓冲液——————————————10ml
溶液Ⅰ(悬浮液)————————————15ml
溶液Ⅱ(裂解液)————————————15ml
溶液Ⅲ (结合液)————————————20ml
溶液Ⅳ (洗涤液)————————————18ml (第一次使用前每瓶加入27ml无水乙醇)
溶液Ⅴ (洗脱液)————————————3ml
RNase A (100mg/ml)——————————15μl
Lyticase———————————————1管
Lyticase配制液————————————1.2ml
小抽质粒纯化柱及废液收集管——————50套

注意事项：
1）第一次使用前把试剂盒提供的RNase A全部加到溶液Ⅰ(悬浮液)中，混匀，并在瓶上做好标记。加入RNase A后4℃存放。
2）第一次使用前在每瓶溶液Ⅳ(洗涤液)中加入27ml无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。
3）第一次使用前吸取1ml Lyticase配制液到Lyticase粉末中，完全溶解后即为Lyticas溶液。配制好的Lyticase溶液4℃可以保存1个月，-20℃可以保存6个月。如需-20℃保存，最好能适当分装。Lyticase溶液配制后或冻存后再溶解可能会出现轻微混浊，属正常现象，请混匀后使用。
4）温度较低时，溶液Ⅱ和溶液Ⅲ可能会有沉淀产生。使用前必须检查一遍。如有沉淀，37℃水浴加热溶解，混匀后使用。溶液Ⅱ请勿过分剧烈混匀，否则会产生大量气泡。
5）溶液Ⅱ使用完后，一定要盖紧瓶盖，防止被空气中二氧化碳酸化。
6）溶液II有强碱性，溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和Lyticase对人体都有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护。
7）本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
8）废液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。
9）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

储存条件：室温，有效期一年。（其中，Lyticase需-20℃保存）