BTN91104A型Denhardt溶液(同位素探针)说明书

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百奥莱博专业生产销*(代"售")BTN91104A型Denhardt溶液(同位素探针)说明书，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：BTN91104A型Denhardt溶液(同位素探针)说明书
编号：BTN91104A
规格：250mL
英文名：Denhardt Solution
品牌：百奥莱博
产地：北京
本产品是最经典的、用于核酸膜杂交时降低膜对标记探针的非特异结合的试剂，早在Southern杂交出现前10年由Denhardt发明，该产品可用与Southern(含单拷贝基因)、Northern、非同位素杂交(B型规格)，与硝酸纤维素膜、尼龙膜等各种常用的核酸杂交介质兼容。A和B分别适用于同位素和非同位素探针。

储存条件：低温运输、-20℃保存、有效期一年。

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·无缝克隆试剂盒
编号：BTN160680
英文名称：Seamless Cloning and Assembly Kit
规格：25次
无缝克隆是一种简单、快速、高效的DNA 定向克隆技术，该技术突破传统，不依赖内切酶和连接酶，不受限制性内切酶酶切位点的限制，利用同源重组的原理，可将任何DNA片段克隆至任何载体的任何位点。反应及转化时间短，阳性率达95%以上。

产品特点：
1. 简单、高效地定向克隆DNA片段。
2.可同时定向克隆两个或多个DNA片段。
3. 不依赖内切酶和连接酶，不受限制性内切酶酶切位点的限制。
4. 省时，反应时间加转化时间短至20分钟。
5. PCR产物(仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体)可直接进行重组反应，无需纯化。

试剂盒组成：

 

成分	规格
2×Seamless Mix	125μl
阳性对照DNA片段I	10μl
阳性对照DNA片段II	10μl
阳性对照线性化载体	10μl
超纯水	1ml
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

1. 线性化载体的制备：
 可通过单酶切、双酶切或PCR扩增的方法来制备。(如果线性化不彻底，将会导致阴性克隆的产生，推荐使用双酶切或PCR扩增的方法。)
2. DNA片段的制备：
 1)DNA片段可通过PCR扩增或酶切的方法制备，PCR扩增片段无需纯化即可用于重组反应。
 2)PCR扩增法引物设计原则：
  A.引物的3´端必须包含18-50个能与模板DNA 结合的碱基序列，以便PCR扩增出目的DNA片段。
  B.引物的5´端必须包含15-80个与线性化载体末端同源的碱基序列，以便PCR扩增片段能与线性化载体进行重组反应。
3. 重组反应：
 1)按照如下体系操作：
 2)50℃反应15分钟，然后将离心管放置于冰上。如当天不进行转化实验，请将连接产物放-20℃保存。
 注：线性化载体建议使用20-60 ng，DNA片段按照与线性化载体摩尔比3：1使用。
4.转化：
 1)取5μl连接液至50-100μl 刚刚融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴2-30分钟。
 2)42℃水浴热激30秒。
 3)立即放置于冰上静置2分钟。
 4)加入300-500μl 无菌SOC或LB培养基(不含抗生素)，37℃，200-250rpm 振荡培养60分钟。
 5)吸取 200μl菌液涂板，为得到更多克隆，可先3000 g离心2分钟，弃掉部分上清，用移液器轻吹菌体，至充分悬浮，取全部菌液涂板，然后37℃培养过夜(12-16小时)。
5. 用菌落PCR、直接测序或其他方法鉴定重组子。
6. 阳性对照反应(可选)
 将本试剂盒提供的阳性对照DNA片段和线性化载体按如下体系操作：
阳性对照DNA片段I(600bp，20 ng/μL)

或阳性对照DNA片段I(900bp，30ng/μL)

1μl
阳性对照线性化载体(2.8kb，30ng/μL)	1μl
2×Seamless Mix	5μl
超纯水	3μl

 50℃反应15分钟，然后按照步骤4转化涂板后用菌落PCR、直接测序或其他方法鉴定阳性重组子。


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·农杆菌GV3101化学感受态细胞
编号：BTN140384
英文名称：E.coli GV3101 Chemical Competent Cell
规格：10×100μL
 本产品为GV3101农杆菌化学感受态细胞，其具有利福平和庆大霉素抗性，适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作，经pCAMBIA2301质粒检测转化效率高达104cfu/μg。

基因型：C58(rifR)Ti pMP90(pTiC58DT-DNA)(gentR/strepR)Nopaline。

储存条件：干冰运输、-80℃保存，有效期一年。

自备试剂：质粒DNA、液氮等

使用方法：

转化前准备
1. 冰水浴和37℃水浴。
2.液氮或干冰/乙醇混合物。
3. 将抗性平板在 28℃培养箱中平衡至少15分钟。
转化方法
1. 取-80℃保存的农杆菌感受态细胞于冰水浴中融化。
2. 无菌条件下，向刚刚融化的感受态细胞悬液中加入需要转化的质粒，每100μL感受态细胞加1μg质粒DNA，轻柔混匀。冰水浴中静置10分钟。
3. 将离心管置于液氮中速冻 5分钟(注：也可以用干冰和无水乙醇混合物替代液氮)。
4. 迅速将离心管置于37℃水浴静置中5分钟，不要晃动水面。然后快速转至冰水浴中静置5分钟。
5. 加入800μl 无抗生素的2×YT或LB液体培养基，28-30℃振荡培养2~3小时。使菌体复苏，表达抗性。
6. 5000rpm离心1分钟收菌，保留100μl左右上清，轻轻吹打重悬菌体，均匀涂布到含有相应抗生素的LB 固体培养基平板上，待平板中的液体完全吸收后，倒置平板，28-30℃培养48-72小时。
 注：当平板只含有50μg/mL kan时，28℃培养48小时即可；平板中同时加入50μg/mL kan，20μg/mL rif时，需 28℃培养 60h；如果使用的平板含有50μg/mL rif 则需要 28℃培养 72-90小时。

注意事项：
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10 ；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
2. 混入质粒时应轻柔操作。
3.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
4. 利福平浓度不应高于25μg/μL，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有 50μg/mL kan，若所用平板含有 20μg/mL rif 则转化效率降低到1/2。
5.培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止 Ti质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。
6.相关抗生素配方：

抗生素	配方	原液	工作液
羧苄青霉素(carb)	双蒸水溶解	50mg/mL	50μg/mL
硫*(代"酸")卡那霉素(kan)	双蒸水溶解	50mg/mL	50μg/mL
链霉素(strep)	双蒸水溶解	10mg/mL	50μg/mL
利福平(rif)	DMSO溶解	10mg/mL	20μg/mL
庆大霉素(gent)	双蒸水溶解	20mg/mL	40μg/mL

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