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    五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒(PCR法)

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    五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒(PCR法)

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      • 货号:

        YJ011202 L

      • 供应商:

        上海一基实业有限公司

      • 数量:

        100

       致病微生物系列
      致泻大肠埃希氏菌鉴定剂盒(PCR法)
       
      产品说明
      大肠埃希氏菌鉴定剂盒参照GB4789.6—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》进行设计,可针对食品样品中的大肠埃希氏菌特异核酸片段进行扩增,通过电泳判断样品的鉴定结果。该产品检出限为10^3 cfu/ml(使用旋达071021M细菌基因组DNA提取试剂盒提取1 ml 10^3cfu/ml增菌液的细菌基因组DNA作为模板)。
      一管式检测试剂为本公司研发的产品,与传统PCR法检测试剂具有等效的检测性能,其中的固封液不影响检测反应与荧光检测性能,并且对试剂蒸发与气溶胶污染起到一定的防范作用。该产品无需分装试剂,有效减少反复冻融及分装过程中造成的试剂活性下降及试剂污染,无需增设试剂配置区,省时省力省空间。(该产品反应液中已含荧光染料,可直接使用荧光定量PCR仪进行定性检测)
       产品组成(96测试)
      试剂 含量 作用
      1 反应液-uidA 23μl/
      12/
      8
      (本产品使用12PCR管分装,每排含12种反应液各23ul
      内参
      2 反应液-ipaH 鉴定EIEC
      3 反应液-pic 鉴定EAEC
      4 反应液-aggR 鉴定EAEC
      5 反应液-astA 鉴定EAEC
      6 反应液-stx1 鉴定EPECEHEC
      7 反应液-stx2 鉴定EPECEHEC
      8 反应液-bfpB 鉴定EPECEHEC
      9 反应液-escVa 鉴定EPECEHEC
      10 反应液-lt 鉴定ETEC
      11 反应液-stp 鉴定ETEC
      12 反应液-sth 鉴定ETEC
      NG-Ecoli  100μL × 1 阴性对照
      NG-DW  100μL × 1 空白对照
      PG-Ecoli  100μL × 1 阳性对照
      Loading Buffer  600μL×1 电泳上样缓冲液
       所需仪器
      ABI BioRadTaKaRaPCR扩增仪,电泳仪,凝胶成像仪等电泳配套设备。(使用荧光定量PCR仪进行定性判读时则无需电泳设备)
       自备耗材和仪器
      灭菌1.5mL2.0mL离心管;冰盒;移液器(1-10μL10-100μL100-1000μL)及配套灭菌吸头;离心机;涡旋混匀器;金属浴。
       样品处理
      参照《GB4789.6—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》中的操作步骤进行前增菌。建议使用试剂配套细菌基因组DNA取系列产品。
       实验操作
      1.添加模板(样本制备区,放置于冰盒中进行)
      取所待检样品数+312联反应管,将试剂完全解冻,分离心30s。离心后揭开封口膜,使用穿刺加样法穿过固封层向每管反应液中分别加入2μL模板(或直接使用无菌吸头挑取少许待检菌落至反应管中)
      加样示例:(有2个待测样品)
      512联反应管,按顺序第一排全部加NG-DW,第二排全部加NG-Ecoli,第三排全部加样品1,第四排全部加样品2,第五排全部加PG-Ecoli
      盖好配套的PCR管盖后,涡旋混匀30s,离心1min,立即进行PCR扩增反应。
      2. 扩增反应(扩增及产物分析区)
         按下列条件设置扩增反应:(如需使用荧光法进行检测请选择FAM通道)
      PCR循环 荧光收集位点
        95   10分钟 1个循环
        95    30 30个循环
        63    30
        72 90
        72 5分钟 1个循环
      3. 产物电泳(扩增及产物分析区
      称量4. 0g琼脂糖粉,加入至200 mL1×TAE电泳缓冲液中充分混匀。使用微波炉反复加热至沸腾直到琼脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液待琼脂糖溶液冷却至60左右时加入溴化乙锭( EB )至终浓度为0.5μg/mL充分混匀后轻轻倒入已放置好梳子的模具中凝胶长度要大于10cm厚度宜为3mm~5mm。检查梳齿下或梳齿间有无气泡用一次性吸头小心排掉琼脂糖凝胶中的气泡。当琼脂糖凝胶完全凝结硬化后,轻轻拔出梳子小心将胶块和胶床放入电泳槽中样品孔放置在阴极端。向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液液面高于胶面1mm~2mm。将 5μL PCR产物与1μL 上样缓冲液混匀后用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下胶孔小心上样于孔中阳性对照的 PCR 反应产物加入到最后一个泳道;第一个泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker 。接通电泳仪电源根据公式电压=电泳槽正负极间的距离cm×5V/cm计算并设定电泳仪电压数值启动电压开关电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准电泳30min~45min切断电源。取出凝胶放入凝胶成像仪中观察结果拍照并记录数据。
      1. 可使用Gold viewGal-Rad等等效的核酸荧光染料替代EB
      2. 推荐使用DNA MarkerDL2000100bp ladder,等可指示100bp~1500bp条带的Marker
      • 结果分析
      1. 阴阳性判读:
      进行电泳检测时,需对比Marker进行判断,当目的靶标对应位置出现单一显著条带时可判断该靶标为阳性;否则为该靶标检测为阴性。(使用荧光定量PCR仪检测时,检测孔Ct30时判断该孔为阳性;当检测孔Ct30该检测孔为阴性)


      示例电泳图
      1. 有效性判读:
      需同时满足:1.空白对照中所有泳道均为阴性;2.阴性对照中uidA泳道阳性,其余泳道阴性;2.阳性对照中所有泳道阳性,此时可判断实验有效。如无法满足上述条件,则实验无效,需重复实验;如重复后结果仍为无效,请于本公司技术支持联系。
      1. 结果判读:
      在实验有效的情况下,可根据下表进行判读:
      大肠埃希氏菌类别 目标条带的种类组合
      EIEC ipaH(+) uidA
      (+/-)
      EAEC aggRastApic中一条或一条以上阳性
      EPEC bfpB(+/-),eae(+),stx1(-)stx2,(-)
      STEC/EHEC stx1stx2中一条或一条以上阳性,eae(+/-),bfpB(-)
      ETEC ltstpsth中一条或以上阳性
      1. 97%以上大肠埃希氏菌为uidA阳性,可参考阴性对照中该基因检测结果判断扩增效果;
      2. 当结果判定为EPEC阳性时,若bfpB靶标为阳性则说明样品含有典型EPEC;若bfpB靶标为阴性则说明样品为非典型EPEC
      3. 当结果判定为STEC/EHEC阳性时,若eae靶标为阳性则说明样品含有典型EHEC;若eae靶标为阴性则说明样品为非典型EHEC
       注意事项
      1.本试剂检测灵敏度高。为了防止污染,实验要分区操作。
         1)第一区:样本制备区。
         2)第二区:扩增及产物分析区。
          分区之间最好进行物理性隔离,避免人为因素造成的污染。
      2. 实验过程中穿戴工作服和乳胶手套,使用移液器,试验产生的所有废弃物及时处理。
      3.严格按照操作步骤操作,试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰上操作。
      4.反应液中的成分对光敏感,应避光保存。试剂使用前要完全解冻,但应避免反复冻融,推荐使用前离心30秒。
      5.不同批号试剂请勿混合使用,在有效期内使用。
      温馨提示:不可用于临床治疗。

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    上海一基实业有限公司

    • 联系人:

      张经理

    • 所在地区:

      上海浦东张杨北路5972号

    • 业务范围:

      试剂,原辅料包材,实验室仪器 / 设备,耗材,抗体,ELISA 试剂盒

    • 经营模式:

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