可保种型蓝白T载体说明书

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

百奥莱博专业生产销*(代"售")可保种型蓝白T载体说明书，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：可保种型蓝白T载体说明书
产地：国产|进口
规格：50 ng
编号：BTN60803
英文名：Blue-White Vector T
品牌：百奥莱博
本产品是环状的可以制备Clion蓝白T载体的质粒DNA。T载体是克隆PCR扩增产物的必不可少的工具，但是由于市场上的各种T载体质量参差不齐，用户很难购买到满意的产品；同时购买的T载体为线性DNA，不能保种，必须反复购买，累计成本很高。为解决这一问题，我司特推出可保种型T载体，用户只需要购买Xcm I内切酶就可以自己制备高质量的T载体，随用随配，十分方便。

产品特点：
1.一次购买，终身拥有。本产品提供制备T载体用的环形质粒DNA，可以象其他质粒一样保种并长期保存。
2. 随用随配，十分方便。用户只需要提供Xcm I 限制性内切酶和基本分子生物学实验条件，就可以自己制备T载体。整个过程只需要两天。
3. T载体含T 率为100%。本方法不是使用传统的加尾法，而是使用Xcm I酶切法。质粒的多克隆位点上预先插入了一段长为1.3 Kb的Xcm I DNA片段,经Xcm I酶切后回收得到的质粒DNA(T载体)两端自然全部带有T 突出，比例远远高于用Taq DNA聚合酶加尾法和TdT 加尾法得到的T载体。
4. 方便各种下游操作。用本产品得到的蓝白T载体插入位点两侧有多种常见的酶切位点，便于后续克隆； Xcm I 位点在Alpha 互补区，可以使用蓝白斑筛选重组子；两边还有T7和SP6 RNA聚合酶启动子，便于制备RNA探针。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期两年。

使用方法：

一.细菌的转化
1. 将100μl感受态细胞于冰上解冻。注意：最好使用end A1菌种(如DH1、DH5、DH5、JM109、XL1-Blue等。常用宿主细菌的基因型可以参考《分子克隆手册》等参考书)。因为这类细菌所含DNase少，制备T载体后，残留的DNase对的T末端的破坏机会更小。
2. 取5-10μl本产品加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。在冰上放置30分钟。
3. 将管放入预加温到42℃的水浴中，热休克90秒。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2分钟。
4. 每管中加900μl LB培养基，37℃振荡培养1小时。
5. 取100μl培养液涂布到含Amp的LB琼脂平板表面。
6. 将平板置于室温直至液体被吸收。
7. 倒置平皿，于37℃培养，12～16小时后可出现菌落。

二.细菌的鉴定
1. 挑取单个菌落进行过夜细菌培养。
2. 按常规的方法进行质粒小量制备。
3. 用Xcm I内切酶按下面条件酶切提取的质粒DNA，如果大规模酶切，需要按比例增加各成分用量:

 

成分	使用量
Xcm I Buffer,10×	5μl
质粒DNA	<或= 2μg
Xcm I	1μl
超纯水	加到50μl

 37℃保温一小时，65℃保温20分钟使酶失活。
4.电泳，本产品被Xcm I酶切后将产生3 Kb和1.3 Kb的两段DNA。
5. 如果Xcm I酶切图谱正确，则按常规的方法进行细菌的保种。

三. T载体的制备
1. 参考《分子克隆手册》等参考书培养细菌和提取质粒DNA。注意：一定要去尽可能去除残留的RNA和蛋白质(含残留DNase)的污染。
2. 用Xcm I酶切质粒。注意：酶切时间最好不要超过一小时，避免残留的DNase对T末端的破坏。
3.电泳后切下含3Kb DNA(既蓝白T载体)的胶段。注意：千万不要用UV照射将要回收的片段，因为UV会使DNA交连，使DNA失去转化细菌的能力。如果酶切的DNA量大，可以使用百奥莱博绿如蓝核酸染料,可以直接在可见光和黑背景下切胶。如果别无选择，最好在长波(360nm)紫外灯下快速切胶，尽可能切掉多余的凝胶。为避免DNA交连，可以使用百奥莱博的DNA防护剂UV Scavenger(BTN60601)
4. 用常规DNA回收方法进行胶回收。
5. 测定T载体DNA的浓度后，将T载体DNA保存在-20℃备用或直接使用。

四.连接反应
1. 短暂离心装有T载体的离心管。
2.在两个离心管中加入下列成分：

成分	样品管	阴性对照管
T4 Ligase Buffer，10×	1μl	1μl
蓝白T载体	20-50ng	20-50ng
PCR 纯化产物	50-500ng	不加
T4 Ligase	3-5U	3-5U
补水到	10μl	10μl

注意: PCR纯化产物与蓝白T载体的摩尔比最好为3:1-10:1。
3. 用移液器吹打连接反应使之混匀后，16℃孵育12小时(或按T4 Ligase供货商提供的操作说明书进行连接)。

五.细菌转化和鉴定
1. 取5μl连接产物进行转化，具体步骤见本手册一，最好使用含X-gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板以便进行蓝白筛选。
2. 按经典的质粒提取+酶切或测序鉴定，可以选用的、在插入位点两侧都有酶切位点的酶有BstZ I、EcoR I和Not I。可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。按菌落PCR方法筛选，可选用百奥莱博的菌落PCR试剂盒(BTN50901)进行快速筛选，需要T7和SP6 RNA聚合酶启动子引物。

MCS位点：


除可保种型蓝白T载体说明书外，我公司正在打折促销以下产品：

·一站式miRNA柱式提取试剂盒
编号：BTN80104
英文名称：One-stop miRNA column extraction kit
规格：50次
本试剂盒是目前国内外市场上最快速最简单的小RNA分离纯化产品。

试剂盒特点：
1.一步法直接分离纯化小RNA，比两步法(先分离总RNA和再纯化其中的小RNA)和PAGE电泳回收法更简单。得到的小RNA长度大部分在200nt以下，包括5S RNA、tRNA、miRNA、Pre-miRNA、pri-miRNA、siRNA、shRNA和snRNA等。
2. 柱式操作，比miRNA提取试剂盒更加简单快捷，整个过程只需要十多分钟。
3.适用范围广，可以用于动物组织、血液及部分植物组织等实验材料。
4.小RNA 纯净，OD260/280一般都在1.9以上。
5.产率一般为20-40μg/100mg动物组织。
6. 无基因组DNA的污染。
7.可用于RT-PCR、miRNA 标记、microarray等后续实验。

试剂盒组成：

成分	规格
溶液A	25ml
溶液B	25ml
溶液C	50ml
离心吸附柱	100套
通用洗柱液	50ml
RNA洗脱液	10ml
说明书	1份

储存条件：常温运输，4℃保存，有效期一年。

使用方法：
由于离心吸附柱的吸附量限制，本产品每次提取只能处理100mg左右的各种组织，可以在1.5mL塑料离心管中。如果处理样品量大，请分成很多相当于微量提取的量进行，最后再收集在一起。

1. 新鲜配制裂解液。将溶液A和溶液B按1:1的比例混合，然后根据组织细胞类型的不同分为下面及种情况使用。注意：溶液A和溶液B混合后必须立即使用，不要放置，否则会产生沉淀。
a)对贴壁细胞：吸尽培养液，在每10平方厘米细胞中加入1mL新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。
b)对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每1-5×106 悬浮细胞中加入1mL新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。如果是fibroblasts或carcinoma cell，1mL 新鲜配制的裂解液的细胞使用量不要超过1×106个细胞。
c)对新鲜的动物组织：先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入10mL或15mL塑料离心管中，每50-100mg 组织加1mL 新鲜配制的裂解液，用匀浆器匀浆30秒左右。对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织(细胞中含大量正在复制的DNA)，建议组织的使用量不要超过50mg/mL裂解液，否则十分容易产生DNA污染。
d)对新鲜的植物组织：先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入10mL或15mL塑料离心管中，每50-100mg 组织加1mL 新鲜配制的裂解液，用匀浆器匀浆30秒左右。
e)对 RNAhold 保存动物或植物组织：先用纸吸去RNAhold液体后再剪切成小块，放入10mL或15mL塑料离心管中，每50-100mg组织加1mL新鲜配制的裂解液，用匀浆器匀浆30秒左右。
2. 将裂解物转移至一个干净的1.5mL塑料离心管中，然后加入0.2倍体积的自备*仿(1mL裂解物需0.2mL *仿)，振荡器上充分振荡混均30秒。
3. 12000～15000g室温离心3～5分钟。
4. 将上清液(约0.6-0.8mL)转移到一根离心吸附柱中以去除大RNA(最好标记以跟后面要用的专门吸附小RNA的另一离心吸附柱区别开来，本试剂盒提供的离心吸附柱之间没任何区别，可以随机选一个做大RNA 吸附，另一个做小RNA 吸附)。注意：离心后下层有机相和中间层含有DNA和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和DNA污染。为保险起见，可以留下100μL上清液不取。同时吸取上清时最好缓慢进行，否则容易吸出交界面的不可见的丝状DNA。
5. 12000～15000g室温离心半分钟，收集管中的穿透液。大RNA 及DNA将与离心吸附柱的膜结合，小RNA 将存在于穿透液中。但由于离心吸附柱的最大吸附能力为40μg动物RNA，20μg植物RNA，如果样品中的大RNA含量高于上面数值，则穿透液中将同时含有大RNA和小RNA，在此情况下，穿透液需要再次重复上柱以去除大RNA。由于此时离心吸附柱已经吸附了大RNA，所以需要预处理(具体步骤见本手册最后的附录)。
6.在最后得到的不含大RNA的穿透液中加等体积的溶液C，混匀。此时溶液的总体积约1.5mL。
7. 先转移约0.75mL 到一新的离心吸附柱中。注意：不要使用已经使用过的、用来吸附大RNA的离心吸附柱。12000～15000g室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
8. 将上步上柱剩余的样品转移到离心吸附柱中，12000～15000g室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
9. 加 0.7mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，12000～15000g室温离心半分钟，弃穿透液。
10. 加 0.3mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，12000～15000g室温离心半分钟，弃穿透液。此步一般可以省略。
11. 12000～15000g室温离心半分钟以甩出残联液体。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响miRNA的使用。
12. 将离心吸附柱转移到一自备的RNase-free 收集管中，加入50-100μLRNA 洗脱液。
13. 12000～15000g室温离心半分钟，离心管中溶液即为miRNA样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。

附录：
1. 将结合有大RNA和DNA的离心吸附柱中加入0.1mL自备的超纯水,12000～15000g室温离心半分钟，弃收集液。
2. 再加 0.1mL自备的超纯水，重复上步一次。
3. 将第5 步的得到、需要进一步去除其中大RNA和DNA污染的穿透液直接上柱，12000～15000g室温离心半分钟，收集穿透液(此穿透液含小RNA)。
4. 如果大 RNA 已经去干净，可以直接进入第6 步；如果大RNA 没有去除干净，则用本附录1-2的方法处理离心吸附柱，然后再将此穿透液加入(接本附录第3 步)。一般样品只需要额外处理一次就可以去除全部的大RNA污染。


可保种型蓝白T载体说明书关键词：可保种型蓝白T载体,Blue-White Vector T,BTN60803

ARB11600 人第八因子相关抗原(FⅧAg)含量分析 Human factor Ⅷ-related antigen,fⅧag ELISA KIT
ARB12353 大鼠阿立新A(OrexIn A)ELISA检测服务 Rat orexin a ELISA KIT
ARB10219 人β位淀粉样前体蛋白裂解酶2(BACE2)定量分析 Human beta-site app-cleaving enzyme 2,bace2 ELISA KIT
NF-215 羊抗人Tf血清
BTN120508 肠激酶(轻链) Enterokinase,Light Chain
BL0766 AMV Reverse Transcriptase  反转录酶
邻*二甲*(代"酸")二己酯 Putrescine dihydrochloride 84-75-3
ARB13589 兔子血栓调节蛋白(TM)elisa检测操作说明书 Rabbit thrombomodulin,tm ELISA KIT
ARB11138 人肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA代测服务 Human tumor necrosis factor α,tnf-α ELISA KIT
ARB10485 人白介素23(IL-23)elisa测定使用说明书 Human interleukin 23,IL-23 ELISA KIT
RN0501 RNAmisi microRNA快速提取试剂盒
戊二醛固定液(2%)   500ml
可保种型蓝白T载体说明书关键词：可保种型蓝白T载体,Blue-White Vector T,BTN60803

*甲*(代"酸")* K-Carrageenan Karra Type 582-25-2
F030440 胶体金标记兔抗驴IgG抗体 Polyclonal Rabbit Anti-Donkey IgG*GOLD
F020214 兔抗马IgG抗体 Rabbit Anti-Horse IgG
PY02-351  亚硫*(代"酸")铁琼脂  250克  
69-89-6 Xanthione  黄嘌呤
ARB14075 人腺病毒Ⅶ抗体(AdenovIrus Ⅶ-Ab)酶联免疫定量检测 
*化*(代"*")溶液(3.5mol/L,无菌)   500ml
11070-73-8 Insulin 牛胰岛素
BTN130504 凝胶法内毒素半定量试剂盒 Gel Based TAL Kit
PY01-023  琼脂粉  250|100克  
HEPES溶液(pH7.0)  1mol/L 100ml
ARB10832 人抗角蛋白抗体(AKA)尿液中含量检测 Human anti-keRatin antibody,aka ELISA KIT
荧光素酶 Luciferase from Bacteria 61970-00-1
81-88-9 Rhodamine B 罗丹明B
ARB12325 大鼠肝脂酶(HL)Elisa分析 Rat hepatic lipase,hl ELISA KIT
SJ0241 F-12 Nutrient Mixture
ARB12069 大鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)酶联免疫定量检测 Rat macrophage colony-stimulating factor,m-csf ELISA KIT
高温油脂Ⅲ Agarose 12704-91-5

北京百莱博科技有限公司是克隆与表达产品的专业生产供应销*(代"售")商，恭候您的咨询选购可保种型蓝白T载体说明书。