连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2.1

【交流】关于NEB的T4 DNA连接酶和快速连接试剂盒的常见问题及解答

连接酶，反应10分钟。平滑末端连接：在20µl反应体系中加入1µl T4 DNA 连接酶反应2小时，或者加入1µl高浓度T4 DNA 连接酶反应10分钟。 另外，NEB的快速连接试剂盒 (Quick Ligation Kit, NEB #M2200V [15个反应])是独有的可以在室温5分钟条件下连接平滑末端和粘性末端的试剂盒。 图1：在25°C条件下，用1 unit（1:400稀释后取1 µl）T4 DNA连接酶连接λDNA/Hind Ⅲ片段(4-碱基粘端)不同反应时间的结果。 图

DNA的连接

片段末端接上合适的接头（linker）或衔接头（adapter）使其匹配，也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3’凹端，使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。 4.1.2 DNA连接酶类型 能用于连接DNA的酶有2种：大肠杆菌连接酶和大肠杆菌T4噬菌体所编码的T4-DNA连接酶。前者的反应需要NAD+参与催化，而T4连接酶的反应则需要ATP参与催化。最初的研究表明，大肠杆菌连接酶只能催化粘端的连接，现在发现在PEG或聚蔗糖存在的条件

PCR产物的TA克隆 (DNA的胶回收和连接)

原理】 1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。 2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。