2×SYBR qPCR MasterMix北京厂家

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2×SYBR qPCR MasterMix北京厂家的品牌：百奥莱博，是优质的核酸扩增(PCR)产品，用于生化科研试验，本产品质量好，且极具价格优势，深为用户称道，了解更多2×SYBR qPCR MasterMix等核酸扩增(PCR)产品请联*(代"系")我司咨询订购。

名称：2×SYBR qPCR MasterMix北京厂家
编号：RFT094
品牌：百奥莱博
产地：国产|进口
规格：1ml|5×1ml|20×1ml
本制品是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。已经将 Hot-Start DNA聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液和 SYBR? Green I 等试剂预混成一种适合 Real Time PCR反应检测用 2×MasterMix试剂，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。使用时只需加入模板、引物和水，便可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对目的基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。以50μl qPCR反应体系为例，每次使用25μl 2×MasterMix，1ml可做40次 50μl qPCR反应。

使用方法：
1、冰浴中彻底融化2×qMasterMix，彻底混匀后快甩离心将溶液收集到管底。
2、按照下表在0.2ml PCR管中制备反应体系：

 

	50μl反应体系	20μl反应体系	终浓度
2×qPCR MasterMix	25μl	10μl	1×
上游引物 10μM	1μl	0.4μl	0.2μM
下游引物 10μM	1μl	0.4μl	0.2μM
ROX Slolution I or II(50×)	1μl or 不加	0.4μl or 不加	x
模板	×μl	xμl	10pg-100ng
水	补至50μl	补至20μl

3、快甩离心将反应液收集到管底。
4、检测片段大于300bp，qPCR仪上推荐执行以下程序(三步法)：

步骤	温度	时间	循环数
初始变性	95℃	10min*	1
变性	95℃	15sec	40
退火	55℃	30sec
延伸	72℃	30sec

检测片段小于300bp，qPCR仪上推荐执行以下程序(两步法)：

步骤	温度	时间	循环数
初始变性	95℃	10min*	1
变性	95℃	15 sec	40
退火和延伸	60℃	60 sec

注：由于本MasterMix中的Hot-start DNA聚合酶是经过化学修饰封闭的，初始变性95℃ 10分钟是必须的，时间过短会降低酶的活性。

实验结果分析
反应结束后加做融解曲线，以区分扩增产物及引物二聚体。根据扩增曲线和融解解曲线结果可进行PCR定量标准曲线的制作。

注意事项
1、本制品中不含内参染料ROX，ROX染料单独供应。客户并根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加ROX内参染料，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。
2、本制品含SYBR Green I，强光下易分解，使用时避免长时间强光照射本制品。
3、建议在冰上配制qPCR反应液，再放入qPCR仪器中扩增。可以提高扩增特异性，减少背景。
4、-20℃下保存时间较长，有微量沉淀产生，充分混匀后不影响使用。本制品已经优化了反应缓冲液中的Mg2+浓度，无需再调节Mg2+浓度。
5、模板DNA：用本产品，cDNA、基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA等都可作为模板。在添加DNA模板时请注意模板量对PCR扩增的影响。本产品建议添加量为：cDNA添加量不应超过总反应体系的10%；基因组DNA为模板时，为避免在高浓度区域出现线性差的情况，请注意添加量小于500ng；病毒DNA也可作为PCR模板，添加时请以300ng为上限；由于质粒DNA浓度和拷贝数很高，在添加PCR模板之前最好进行稀释梯度试验，以便确定合适的质粒DNA拷贝数。
6、引物：
建议每条引物工作浓度200 nM～800 nM；为得到高灵敏度定量性的数据，引物的设计非常重要。以下列举了设计引物时需注意的一般事项。
a.引物长度请设定为18bp～30bp、GC含量为40%～65%；
b.扩增片段一般小于300bp，如可能请尽量设定在80bp～150bp。过长的片段容易导致扩增效率降低；
c.如设计mRNA为目的片段的引物，设计应尽量横跨内含子，以防止基因组DNA的扩增而引起假阳性；
d.请尽量选择Tm为65℃～67℃；
e.A、G、C、T整体分布尽量均匀。不要有部分的GC rich或AT rich(特别是3"端)。避开T/C(Polypyrimidine)或A/G(Polypurine)的连续结构；
f.避开引物内部或两条引物之间有3个碱基以上的互补序列。二条引物间的3"末端避开有2个碱基以上的互补序列；
g.引物设计完成后要使用BLAST检索确认引物的特异性。
此外，引物的纯化纯度对反应特异性有很大的影响。经过一般纯化、纯度较低的引物荧光强度散乱，容易产生非特异性产物，致使熔解曲线出现杂峰。请尽可能使用HPLC级别纯化，至少要用经Cartridge(OPC)级别以上纯化的引物。
7、对照设计：
a.No template control(NTC)：在qPCR反应体系中仅仅缺少模板。用以检测有无二聚体和试剂有无污染。
b.Reverse Transcripase control：用以评估逆转录反应中有无基因组DNA的污染。在逆转录反应中仅仅不含有逆转录酶。

常见问题及处理：

问题	可能原因	推荐的解决方法
无扩增曲线且无扩增产物(凝胶电泳)	反应体系中有PCR反应抑制剂	更换或纯化模板DNA。
	引物设计不合理	重新设计、合成引物。
	逆转录产物体积过量	减少逆转录产物量以不超过反应体系的10%。
	加样错误或有试剂未加	检查是否加了所有的所需试剂。
	引物的降解	通过PAGE电泳检测引物完整性。
	退火温度不正确	优化退火温度。
无扩增曲线但有扩增产物(凝胶电泳)	qPCR仪设置不正确	检查dye selction，reference dye是否选择正确
	失效的荧光检测	荧光检测应在PCR循环的退火/延伸阶段。
	荧光PCR仪问题	参考qPCR仪器说明书
阴性对照(NTC)有扩增曲线
	反应体系中有污染	qPCR片段较小，极易造成环境中气溶胶污染。如果融解曲线分析，解链温度和目的片段相同，凝胶电泳中NTC中的片段大小和目的片段相同，极有可能是反应体系中某一或某些试剂污染所引起的。建议换至没有污染源的环境进行PCR体系的配制。
	引物二聚体	进行溶解曲线分析，如果扩增曲线的解链温度小于80℃，凝胶电泳片段大小和目的片度不符。请重新设计引物。
		提高退火温度3℃。
PCR效率高于110%(斜率>-3.1)	有非特异性扩增	溶解曲线分析非特异性扩增；优化引物设计
PCR扩增效率低于90%(斜率<-3.6)	反应体系中有PCR反应抑制剂	更换或纯化模板DNA
	PCR扩增条件不合适引起扩增效率降低。	确认引物浓度。注意qPCR Master Mix是否失效。
	引物设计	重新设计引物，避免扩增区域的DNA二级结构。
实时荧光曲线线性不好	模板DNA含量较低或过高	应调整样品的DNA浓度。
	模板DNA中含有抑制PCR扩增反应的物质	对模板DNA进行纯化或更换模板。
	质量不好的逆转录试剂盒合成的cDNA，逆转录反应液中所含的物质可能抑制PCR反应。	请降低样品浓度，或将样品纯化后再进行反应。建议使用品牌质量较好的cDNA合成逆转录试剂盒。
CT值高于预期值	加入的模板量太少	适当增加模板量。
	样品被降解	检查样品的完整性。
	引物不合适	重新设计合成引物。
CT值低于预期值	加入了过多的模板	减少模板量。
	PCR产物太长	一般采用100-150bp的产物长度，一般不超过500bp
CT值的标准差>0.16	取样不准确	每种样品的反应混合液单独配制，充分混匀；
		qPCR之前要离心，管壁不要沾有反应液。
ΔRn值太小	PCR效率太低	优化PCR反应条件。
	目标模板数太低	增加模板量。
扩增曲线的荧光信号弱，或扩增曲线呈锯齿状	ROX添加量太大	使请根据ROX使用方法和使用的PCR仪进行确定ROX的添加量。
	荧光校正错误	请联*(代"系")PCR仪器工程师或参照PCR仪器的使用说明书，进行本底和荧光校正。
	PCR的延伸时间过短即荧光读取时间不充分，荧光收集不能充分完成。	适当增加延伸时间。
	以少于PCR仪器标准条件的反应体积进行扩增，荧光收集量的误差会增大	应增加反应体积以满足PCR仪器标准。

储存条件：-20℃，避免反复冻融，有效期半年。

关于2×SYBR qPCR MasterMix北京厂家的更详细说明，请致电我公司咨询，我们将以最饱满的热情为您提供解答，此外，我公司专业供应下列产品：
SJ0809 D(+)鼠李糖
PY08-034  乳糖蛋白胨培养管 10ml  10支/盒，用于饮用水、水源水中大肠菌群的测定
ARB12791 小鼠β干扰素(IFN-β/IFNB)酶免分析 Mouse interferon β,ifn-β/ifnb ELISA KIT
ARB12855 小鼠水通道蛋白5(AQP-5)含量检测 Mouse aquaporin 5,aqp-5 ELISA KIT
ARB13783 豚鼠生长激素(GH)ELISA检测服务 Guinea pig growth hormone,gh ELISA KIT
ARB12928 小鼠皮质酮(CS)含量分析 Mouse corticosterone,cs ELISA KIT
尿蛋白防腐剂   1ml|5ml|20ml 
5×A-plus MasterMix 20次
9003-98-9 脱氧核糖核酸酶 DNAseⅠ
BTN130661 RecA蛋白 RecA
MES buffer(0.1mol/L,pH6.0)   100ml
HC0038 黑色酶标板(不可拆)25块/包
ARB13910 猪血管假血友病因子(vWF)Elisa方法检测 Porcine vwf ELISA KIT
ARB12349 大鼠尿激酶(UK)定量分析 Rat urokinase,uk ELISA KIT
ARB12150 大鼠白介素15(IL-15)酶标法分析 Rat interleukin 15,IL-15 ELISA KIT
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·BL21(DE3)化学感受态细胞
编号：RFT165
英文名称：BL21(DE3) Competent cell
规格：20×100μl
本公司生产的BL21(DE3)感受态细胞采用经特殊工艺处理得到，可用于DNA的化学转化。使用pUC19质粒检测，转化效率可达108cfu/μg，-70℃保存几个月转化效率不发生改变。

产品特点：
1、T7 RNA聚合酶基因的表达受控于λ 噬菌体DE3 区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。
2、适用于T7、T7 lac启动子的表达系统，如pET，pEASY。
3、适用于非毒性蛋白的表达。
4、使用pUC19质粒DNA 检测，转化效率可达10^7 cfu/μg DNA。

注意事项：
1、感受态细胞应保存在-70℃，不可多次冻融和放置时间过长，以避免感受态细胞的转化效率。
2、进行转化操作时，应根据相应温度及无菌条件的要求进行。
3、为防止转化实验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。

操作方法：(以下操作均按无菌条件的标准进行)
1、取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl，可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以下实验以100μl感受态细胞为例。
2、向感受态细胞悬液中加入目的DNA(50μl的感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒DNA所饱和)，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30分钟。
3、将离心管置于42℃水浴中放置90秒，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，该过程不要摇动离心管。
4、向每个离心管中加入500μl 无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素)， 混匀后置于37℃摇床振荡培养45分钟(150转/分钟)，目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
5、将离心管内容物混匀，吸取100μl已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的SOB或LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16小时。

注意：涂布用量可根据具体实验来调整。如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300μl转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心(4000 rpm, 2分钟)后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。(涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板)

储存条件：-70℃，有效期6个月。


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·200bp DNA ladder(200～3000bp)
编号：RFT005
规格：100T(2×250μl)
本产品是由11条带状双链DNA组成的即用型DNA Ladder，适用于琼脂糖凝胶电泳中DNA条带的分析。含有1×loading buffer，可根据实验需要，直接取2-5μl电泳，使用方便，电泳图像清晰。 11条带包括200，400，600，800，1000，1200，1400，1600，1800，2000，3000bp，其中1000bp条带为100ng/5μl，其余条带浓度为50ng/5μl。



使用方法：
1. 取2-5μl本产品加入到琼脂糖凝胶的加样孔中就行电泳。
注：根据梳子的厚度和宽度进行上样。每1mm×1mm(厚度×宽度)加样孔上样1μl。窄齿梳子(一般为1mm×2mm)上样2μl；宽齿梳子(一般为1mm×5mm)上样5μl。如果使用厚齿梳子或宽于5mm的梳子，可以适当调整上样量。
2. 建议电泳条件：凝胶浓度为1.0％，凝胶长度8-10cm，电泳电压4-10v/cm，电泳时间35-40分钟。
3. 通过EB染色后紫外灯下观察条带。

注意事项：
1. 琼脂糖的质量对DNA的电泳有很大影响，电泳时请尽量使用质量优等的琼脂糖。
2. 请使用新鲜配制的电泳缓冲液和新鲜配制的琼脂糖凝胶进行电泳，以保证Marker良好的分离效果。

储存条件：-20℃，有效期1年。

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