TA快速连接试剂盒(pUC-T)厂家直销

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博专注于生命科学和生物技术领域，致力于为客户提供包括TA快速连接试剂盒(pUC-T)厂家直销在内的一系列分子生物学试剂产品，并提供一系列相关的技术服务。

名称：TA快速连接试剂盒(pUC-T)厂家直销
产地：国产|进口
英文名：pUC-T TA Cloning Kit
编号：WE0249
规格：20次
  pUC-T TA载体是一种高效克隆PCR产物的专用载体，它是由pUC18载体在EcoR V酶切位点处切开，在两侧的3"端添加T而成。由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR产物的3"端添加一个A，它可以与pUC-T 3"端的T互补连接，因此可大大提高PCR产物的连接和克隆效率。
  试剂盒中配备高效率的T4 DNA Ligase和为快速高效DNA连接优化的2×Quick Ligation Reaction Buffer。连接效率相当于用T4 DNA Ligase 进行常规连接1小时。带有插入片段的重组子可根据α互补原理，进行蓝白斑筛选，判断载体中有无外源基因的插入。克隆后可以用BcaBEST Sequencing Primers和 M13通用引物对PCR产物进行测序。

试剂盒组成：

 

组份	20次
pUC-T(50ng/μl)	20μl
Control Insert(50ng/μl)	10μl
Quick T4 DNA Ligase	20μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer	120μl

注意事项：

1、Insert DNA 要求
1)连接使用的PCR片段3’末端应带有“A”尾。有些高保真DNA聚合酶，如我公司的Pfu扩增的PCR产物是平滑末端，可使用加A试剂盒加上A尾后，再进行T载体克隆。
2)PCR产物建议进行切胶回收纯化后再进行T载体克隆，以免PCR产物中的非特异片段或残存引物等杂质影响。推荐使用WE0168快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。

2、连接反应要求
1)本试剂盒能使大多数连接反应在25℃条件下5分钟甚至更短时间内达到反应终点，增加反应时间反应效率不会增强。如用快速连接反应1小时后，转化效率会明显降低；如25℃快速连接反应过夜，则转化效率会下降到75%。
2)2×Quick Ligation Reaction Buffer含有ATP，使用前置于冰上使其融化后充分混匀，建议初次使用分装成小管冻存，避免其反复冻融影响DNA连接效率。
3)由于T4 DNA Ligase中含有甘油，比较粘稠容易挂壁，建议使用之前短暂离心将液体收集到管底，取样时枪头尽量不要深入液面太深，以免粘在枪头上造成损失。
4)如快速连接产物用于电转，因快速连接反应体系中的PEG会影响电转效率，建议使用离心柱将连接产物进行DNA纯化(如WE0170快速DNA产物纯化试剂盒)后再进行电转。

3、感受态细胞要求
建议使用高效的热击转化感受态细胞，这样才可能得到比较理想的阳性克隆，如需进行蓝白筛选，宿主细胞必须具有正确的基因型(F´编码的【lacZ ΔM15】)产生ω片段，才能与载体DNA产生的LacZ α 多肽结合，表现出β-半乳糖苷酶活性(α互补)。pUC-T TA载体以pUC18载体为基础构建而成，因此，适合pUC18载体的感受态细胞都可以使用。推荐使用本公司WE0251 TOP10感受态细胞、WE0252 DH5α感受态细胞。

4、阳性克隆筛选
阳性DNA片段成功插入至pUC-T Vector中后，一般情况下β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固体培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。

5、阳性对照
为了确认实验操作的正确性，以及实验试剂的有效性，我们建议使用本试剂盒中配备的Control Insert(750 bp)进行阳性对照实验。

使用方法：

1、按以下体系配制反应液：

成分	反应体系	对照体系
pUC-T	1μl	1μl
DNA 插入片段	0.1 -0.3 pmol	--
Control Insert DNA	--	1μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer	5μl	5μl
Quick T4 DNA Ligase	1μl	1μl
RNase -Free Water	补足至10μl	补足至10μl

注：Insert DNA的使用量：在进行克隆时，Vector DNA和 Insert DNA的摩尔比一般为：1:2-1:10，可根据实验情况选择适当的Vector DNA和 Insert DNA的摩尔数比。Insert DNA的使用量=nmol数×660×Insert DNA bp数。本载体1μl(50ng)的摩尔数约为0.03 pmol。

2、轻轻混合，短暂离心。25℃反应5分钟。
注意：反应时间不要超过15分钟，否则会降低连接效率。
3、反应结束后，将DNA连接产物存放于0-4℃，而后进行转化实验；也可将DNA连接产物置于-20℃保存。
注意：勿进行加热失活反应。
4、将连接产物加入50μl感受态细胞中(将感受态细胞置于冰上融化)，冰浴30分钟。
注意：用化学法转化时，连接产物的加入量不要超过感受态细胞体积的10%。
5、42℃热击45秒钟，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。
6、加入450μl无菌SOC或LB培养基，混匀后置于37℃摇床，150 rpm振荡培养45分钟，使菌体复苏。
7、根据实验要求，取适量已转化的感受态细胞，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固体培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃，直至液体被吸收后，倒置培养，37℃培养12-16小时。
8、计算白、蓝色菌落，挑选白色菌落，使用PCR法或酶切法鉴定插入片段是否正确。



储存条件：-20℃。

关于TA快速连接试剂盒(pUC-T)厂家直销的更详细说明，请致电我公司咨询，我们将以最饱满的热情为您提供解答，此外，我公司专业供应下列产品：

·DNase I(不含RNase)
编号：WE0213
英文名称：DNase I(RNase Free)
规格：1000U
  DNase I是一种需二价阳离子的脱氧核糖核酸内切酶，可用于降解单链或双链DNA。其原理为DNase Ⅰ水解磷酸二酯键产生带有5"-磷酸基团和3"-OH的单核苷酸或寡核苷酸。Mg2+或Mn2+都可以激活DNase I的活性，而Ca2+浓度直接影响酶的活性。Mg2+存在时可在双链DNA的每条单链上随机地产生切口；而在 Mn2+存在下可使双链DNA断裂，使DNA片段化。用于无DNA污染的RNA的制备，逆转录及体外转录等实验。

产品组成：

组份	1000U
DNaseⅠ(RNase Free),1 U/μl	1ml
Reaction Buffer(with MgCl2),10×	1ml
200 mM EDTA	1ml

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1、因为DNase I 经常用于需要保持RNA完整性的DNA消化实验，所以在酶制备过程中最大限度的避免了RNase污染，可以安全地用于RNA的提取，但由于该酶中不含RNase 抑制剂，提醒使用时注意防止外源RNase的污染。
2、DNase I受剪切力的影响比较大，使用前可以将离心管上下颠倒混匀，避免涡旋震荡。
3、每处理1μg RNA，DNase I用量不要超过1U。

使用说明：
1、以制备用于RT-PCR的RNA样品为例，配置10μl反应体系，如下表：

组分	体积	终浓度
RNA	Xμl	1μg
Reation Buffer(with MgCl2)，10×	1μl	1×
DNaseⅠ(RNase Free)	1μl	1 U
RNase Free Water	Yμl	补足至10μl

2、37℃孵育30分钟。
3、加入1μl 200 mM EDTA，65℃孵育10分钟，使DNase Ⅰ失活，终止反应。
4、处理后的RNA可用于RT-PCR。

储存条件：室温(15～30℃)


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·Taq DNA Polymerase
编号：WE0101
英文名称：Taq DNA Polymerase
规格：500U|2500U|10000U
  Taq DNA Polymerase是通过大肠杆菌表达纯化的重组酶。其基因来源于Thermus aquaticus polymerase。该蛋白分子量为94 kDa，具有5"→3"DNA聚合酶活性和5"→3"外切核酸酶活性，无3"→5"外切核酸酶活性，扩增得到的PCR产物3"端附有一个“A”碱基，因此可直接用于T/A克隆。本产品具有延伸速度快、扩增效率高的特点，主要适用于PCR法扩增DNA片段、DNA序列测定等实验。

产品组成：

组份	500 U	2500 U	10000 U
Taq DNA Polymerase(5 U/μl)	100μl	5×100μl	2×1ml
10×PCR Buffer	1.8ml	5×1.8ml	8×5ml

活性定义：用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在74℃，30分钟内，将10 nmol脱氧核苷酸掺入到酸性不溶物质所需的酶量定义为1个活性单位(U)。

质量控制：
1、经过多次柱纯化，SDS-PAGE检测其纯度大于99%；
2、经检测无外源核酸酶活性；
3、PCR方法检测无宿主残余DNA；
4、能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因；
5、室温存放一个月，无明显活性改变。

使用方法：
以下举例为以人基因组DNA为模板，扩增1 kb的片段的PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系：
 

试剂	50μl反应体系	终浓度
10×PCR Buffer	5μl	1×
dNTP Mix，10 mM each	1μl	200μM each
Forward Primer，10μM	2μl	0.4μM
Reverse Primer，10μM	2μl	0.4μM
Template DNA	<0.5μg	<0.5μg/50μl
Taq DNA Polymerase	0.25-0.5μl	1.25-2.5 U/50μl
ddH2O	up to 50μl

注意：引物浓度请以终浓度0.1-1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。

2、PCR反应条件:
 

步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	2min
变性	94℃	30s	25-35个循环
退火	55-65℃	30s
延伸	72℃	30s
终延伸	72℃	2min

注意：
1)一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
2)延伸时间应根据所扩增片段大小设定，本产品Taq DNA Polymerase的扩增效率为2 kb/min。
3)可根据扩增产物的下游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以在保证产物得率的前提下应尽量减少循环次数。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。

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