HPLC纯度（反相 / 分子筛）

——即蛋白质药物的HPLC纯度测定技术服务
用高效液相色谱（HPLC）的方法，根据蛋白质保留时间的差异分离蛋白质，通过峰面积积分测定蛋白质的纯度。利用样品中各组分在色谱柱内借助于固定相及流动相的某种物理、化学作用在固定相与流动相之间分配行为的不同来进行分离的，其分离机制有吸附、分配、离子交换、分子排阻、疏水作用、亲和力等，而色谱柱是色谱分离系统的核心部分，装有不同类型填料的色谱柱与相对应的流动相形成不同分离机制，对绝大多数的有机化合物进行分离分析。


“HPLC法测定蛋白质类药物的纯度，是一项基本的生物化学分析技术”

技术指标
◆ 样品要求：
蛋白或肽的总浓度不低于0.5μg/μl，体积不少于50μl，并标明准确浓度，如果需要脱盐及样品浓缩的需要，请说明并标明缓冲液成分。
◆ 测定参数：

样品相对分子质量	蛋白质/多肽	检测波长 (nm)	纯度分析方法	色谱柱	上样量 (μg)
M≤6,000	多肽	214	反相色谱分析法	Agilent, ZORBAX Eclipse XDB-C18	5
6,000<M≤120,000	蛋白质	280	反相色谱分析法	Agilent, ZORBAX 300SB-C8	100
			分子筛色谱分析法	TSK gel G3000SW, 05789	50
M>120,000	蛋白质	280	反相色谱分析法	Agilent, ZORBAX 300SB-C3	100
			分子筛色谱分析法	TSK gel G3000SW, 05789	50

案例分析
◆ 反相HPLC纯度方法实验参数：
流动相A：0.1%三氟乙酸的水溶液；流动相B：0.1%三氟乙酸的yijing溶液；流速：1ml/min；柱温：30℃；梯度洗脱：70min（A液从97% ~ 30%，B液从3% ~ 70%）；检测波长为214nm。
结果谱图：

图为胰岛素标准品在反相HPLC柱上的纯度分析图谱
◆ 分子筛HPLC纯度方法实验参数：
流动相：100% 0.1M PB+0.1M NaCL，pH7.0；流速：0.5ml/min；等度洗脱：30min；柱温：30℃；检测波长为214nm。

图为胰岛素标准品在GSK 3000sw柱上的分析图谱（分子筛）
Q&A

反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离。
分子筛色谱以多孔凝胶作为固定相，依据样品分子量大小达到分离目的。大分子不进入凝胶孔洞，沿多孔凝胶胶粒间隙流出，先被洗脱；小分子进入大部分凝胶孔洞，在柱中被强滞留，后被洗脱。

在HPLC纯度分析中应用到的定量分析方法为峰面积归一法，该方法不需要标准物质帮助来进行定量，而是直接通过峰面积或者峰高进行归一化计算从而得到待测组分的含量。其特点是不需要标准物，只需要一次进样即可完成分析。归一化法兼具内标法和外标法两种方法的优点，不需要精确控制进样量，也不需要样品的前处理；缺点在于要求样品中所有组分都出峰，并且在检测器的响应程度相同，即各组分的绝对校正因子都相等。