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赫澎(上海)生物
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文献和实验【交流】关于NEB的T4 DNA连接酶和快速连接试剂盒的常见问题及解答
连接酶,反应10分钟。平滑末端连接:在20µl反应体系中加入1µl T4 DNA 连接酶反应2小时,或者加入1µl高浓度T4 DNA 连接酶反应10分钟。 另外,NEB的快速连接试剂盒 (Quick Ligation Kit, NEB #M2200V [15个反应])是独有的可以在室温5分钟条件下连接平滑末端和粘性末端的试剂盒。 图1:在25°C条件下,用1 unit(1:400稀释后取1 µl)T4 DNA连接酶连接λDNA/Hind Ⅲ片段(4-碱基粘端)不同反应时间的结果。 图
采用了公司最亲斤发明的特殊中和液Buffer N8,可使用户在8分钟内快速从1~5 ml细菌培养物(LB培养基)中提取多至30 mg高纯度的质粒DNA,适用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化、强壮细胞转染等分子生物学实验。
。 由此题我发现,目的基因由两种限制酶切割,一端由EcoRI切出黏性末端,另一端由AluI切出平末端;载体质粒由两种限制酶切开,一端由EcoRI切出黏性末端,另一端由SmaI切出平末端。在构成重组 质粒时,两个黏性末端碱基互补,由DNA连接酶可以连接上磷酸二酯键,这没有疑议。但是另一端两个平末端也能由DNA连接酶连接上,并且原题中第(3)问“图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求? 。”答案为“否”。 也就是由此题我们可以得出一个结论:DNA连接
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