Cell Counting Kit-8 cck8试剂盒（

Cell Counting Kit-8，简称 CCK-8 试剂盒，是一种基于 WST-8 而广泛应用于 细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒。 CCK-8 溶液可以直接加入到细胞样品中，不需要预配各种成分。WST-8 在 电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色 的formazan。

WST-8 和 WST-8 formazan 的结构式

细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大， 则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅 (生成的 formazan 量) 和细胞数 目呈线性关系 。

CCK-8 的原理图

WST-8 是 MTT 的一种升级替代产品，和 MTT 或其它 MTT 类似产品，如 XTT、MTS 等相比有明显的优点。第一，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原 生成的 formazan 不是水溶性的，需要有特定的溶剂来溶解；而 WST-8 和 XTT 、MTS 产生的 formazan 都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。第 二，WST-8 产生的 formazan 比 XTT 和 MTS 产生的 formazan 更易溶解。 第三，WST-8 比 XTT 和 MTS 更加稳定，使实验结果更可靠。第四，WST-8 和 MTT、XTT 等相比线性范围更宽，灵敏度更高，并且更加稳定。 WST-8 对细胞无明显毒性。加入 CCK-8 溶液显色后，可以在不同时间反复 用酶标仪读板，检测时间更加灵活，便于确定最佳测定时间。

试剂盒可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物 等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。
1. 制作标准曲线
a. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞；
b. 按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 5-7 个细 胞浓度梯度，每组 4-6 个复孔；
c. 接种后培养 2-4 小时使细胞贴壁，然后每 100 μL 培养基加 10 μL CCK-8 试剂培养一定时间后测定 OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD 值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。 使用此标准曲线的前提条件是试验条件完全一致。

2. 细胞活性检测
a. 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) ，将培养板放在培养箱中预培养 24 小时；
b. 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡) ；
c. 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；
d. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

3. 细胞增殖-毒性检测
a. 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) ，将培养板放在培养箱中预培养 24 小时；
b. 向培养板加入不同浓度的待测药物；
c. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间；
d. 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡)；
e. 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；
f. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

4. 计算公式
细胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%
抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%
As: 实验孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液) ；
Ac: 对照孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物) ；
Ab: 空白孔吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液，不含细胞、药物) 。

CCK-8 试剂盒检测细胞活性

注：如果待测药物有氧化性或还原性，可在加入 CCK-8 之前更换新鲜培养基，去掉待测药物的影响。当待测药物影响比较小的情况下可以不更换培 养基，直接扣除培养基中加入待测药物后的
空白吸收即可。

1. CCK-8 的培养时间一般为 1-4 小时，但在培养 30 分钟左右即可取出肉眼 观察显色程度，根据细胞种类而定，需要摸索条件，CCK-8 的最佳反应时 间以具体显色的最佳时间为准。
2. 使用 96 孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问 题。一方面，由于 96 孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的 PBS 、水或培养液；另一方面，可以把 96 孔板置 于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。
3. 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂 (例如一些抗氧 化剂) 会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。 用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。
4. 加入药物中如含有金属，对 CCK-8 显色有影响。终浓度为 1 mM 的氯化 亚铅、lv 化 tie、硫 酸铜会抑制 5% 、15% 、90% 的显色反应，使灵敏度降 低。如果终浓度是 10 mM 的话，将会 100% 抑制。
5. 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过 扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
6. 本产品可以检测 ，但不能检测酵母细胞。向 100 μL 培养液 中加入 10 μL CCK-8 溶液，并培养 1-4 小时或过夜。
7. CCK-8 试剂对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶 液颜色不断加深，OD 值不断增加 (注: 活细胞内的脱氢酶是持续产生的) 。
8. 要测定细胞的具体数量，建议同时做标准曲线。
9. 建议采用多通道移液器，以减小平行孔间的差异。
10. 以下方法可以终止 CCK-8 反应 (96 孔板) ：
(a). 在显色反应后，将培养板放置 4°C 冰箱内。(b). 每孔加 10 μL 0.1 M HCl 溶液。(c). 每孔加 10 μL 1% (w/v) 的 SDS (十二烷基硫酸钠) 溶液。
注意：反应停止后，应在 24 小时内测定。
11. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不 得用于食品或药品。
12. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。