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RNA结合蛋白免疫沉淀RIP/RIP-seq
武汉金开瑞生物工程有限公司
RIP 技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay,RNA 结合蛋白免疫沉淀)主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。RIP 是研究细胞内RNA 与蛋白结合情况的技术,是了解转录后调控网络动态过程的有力工具,可以帮助我们发现miRNA 的调节靶点。
根据需求,金开瑞可以提供RNA/蛋白、RNA/RNA互作验证RIP技术服务。
高灵敏度和高特异性:RIP技术能够高度富集RNA和与之相互作用的蛋白质,具有较高的灵敏度和特异性
低样本量要求:RIP技术可以在较少的细胞或组织样本中进行实验,减少实验成本和样本需求
适用于多种RNA种类:RIP技术适用于不同类型的RNA研究,包括长链非编码RNA和编码RNA
不需要事先了解RNA-蛋白质相互作用的信息:可用于探索未知的RNA-蛋白质相互作用
可量化分析:RIP技术可以进行定量分析,评估不同条件下的相互作用的强度和稳定性
结合其他技术的联合应用:RIP技术可以与其他技术相结合,如RNA测序、蛋白质组学和转录组学等,进行综合分析,深入揭示RNA-蛋白质相互作用的功能和调控机制
目的蛋白抗体(可用于IP)及其说明书;
需检测的细胞样品;
目的基因、目的蛋白信息。
原始数据、结果图片(包括阴性对照结果);
标准实验报告(包括详细的材料与方法);
SCI标准Result Figure。
服务名称 | 服务内容 | 交付内容及标准 | 服务周期(工作日) |
RIP-qPCR | RIP前WB | 1个样本,1个抗体 | 20 |
(Protein-RNA) | RIP | 富集2次:IgG、IP各1次 | |
RIP后WB | IgG,IP,input各1次 | ||
qPCR | IgG,IP,input各1个泳道 | ||
Ago2-RIP | qPCR检测目的RNA 的本底表达 | 含miRNA过表达和对照组,每组含IgG、Ago、Input检测 | 28 |
(miRNA-RNA) | RIP | 富集2次:IgG、IP各1次 | |
qPCR | IgG,IP,input各1个泳道 |
● CO-IP ● RNA pull-down ● DNA pull-down
1、RIP技术的实验步骤
● 细胞提取:从细胞中提取总蛋白质,包括RNA结合蛋白质
● 免疫共沉淀:将提取的细胞蛋白质与特异性抗体结合,形成免疫复合物
● 沉淀:使用蛋白A/G磁珠等具有亲和性的材料,将免疫复合物沉淀下来
● 洗涤:通过洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白质
● 逆交联:将免疫复合物与RNA解离,并逆交联,释放RNA分子
● RNA提取:从逆交联的样品中提取RNA
● 分析:对提取的RNA进行定量PCR、RNA测序或其他RNA分析方法,用于鉴定与特定RNA相互作用的蛋白质
2、RIP技术的应用
● RNA调控网络的研究:RIP技术可以帮助我们揭示RNA-蛋白质相互作用在基因调控中的作用。通过鉴定与特定RNA相互作用的蛋白质,我们可以了解RNA的转录、剪接、稳定性和翻译等方面的调控机制,从而揭示RNA调控网络的复杂性和动态性。
● 疾病相关的RNA-蛋白质相互作用研究:RIP技术可以用于研究与疾病相关的RNA-蛋白质相互作用。通过比较疾病样本和正常样本中的RNA-蛋白质相互作用,我们可以发现与疾病发生和发展密切相关的RNA-蛋白质相互作用,从而提供新的疾病诊断和治疗靶点。
● 新型RNA结合蛋白质的发现:RIP技术可以帮助我们发现新的RNA结合蛋白质。通过鉴定与特定RNA相互作用的蛋白质,我们可以发现那些在传统方法中未被发现的RNA结合蛋白质,从而揭示更多未知的RNA功能和调控机制。
● RNA-蛋白质相互作用在药物研发中的应用:RIP技术可以在药物研发过程中发挥作用。通过研究特定药物对RNA-蛋白质相互作用的影响,我们可以评估药物的效果和安全性,为药物研发提供重要的信息和指导。
3、RIP实验结果不如预期如何优化
(1)低信号强度:如果RIP实验的信号强度较低,可能是由于以下原因:
▶ 优化抗体浓度:尝试调整抗体的浓度,增加或减少抗体的用量,以获得更好的信号与噪音比。
▶ 增加孵育时间:延长孵育时间可以增加目标RNA和蛋白质的结合,从而提高信号强度。
▶ 优化实验条件:调整反应温度、缓冲液成分等实验条件,以最大化结合效率。
(2)高背景噪音:如果RIP实验存在较高的背景噪音,可能需要考虑以下优化措施:
▶ 优化洗涤步骤:增加洗涤步骤的次数和强度,以有效去除非特异性结合物质,减少背景噪音的干扰。
▶ 优化抗体选择:确保选择具有较低非特异性结合能力的抗体,以减少背景信号。
▶ 增加阴性对照:引入适当的阴性对照,如使用非特异性抗体或非相关RNA序列,以帮助区分真实信号和背景噪音。
(3)非特异性结合:如果RIP实验存在非特异性结合问题,可以尝试以下优化策略:
▶ 优化洗涤条件:增加洗涤缓冲液的浓度和洗涤时间,以更彻底地去除非特异性结合物质。
▶ 使用更严格的阴性对照:选择更具特异性的阴性对照,确保它与目标RNA不存在相互作用。
▶ 预实验和对照实验:进行预实验和对照实验,以验证特异性结合并排除非特异性结合的影响。
(4)结果不一致或不可重复:如果RIP实验结果在重复实验中存在不一致或不可重复的问题,可以考虑以下优化措施:
▶ 增加实验重复次数:增加实验的重复次数,以提高结果的一致性和可靠性。
▶ 核对实验步骤:仔细核对实验步骤,确保实验操作的一致性和准确性。
▶ 校准实验条件:重新校准实验条件,包括反应时间、温度和孵育条件等,以确保实验的可重复性。
武汉金开瑞生物工程有限公司是一家专业致力于为全球制药企业、诊断试剂企业、科研试剂研发企业、高校和科研院所以及大型医院提供蛋白及相关研究技术服务的高新技术企业。金开瑞极其注重平台技术提升,现已有多项自主知识产权和软件著作权专利,并已通过ISO9001质量管理体系认证,2018获批“千企万人”支持计划。公司以“细胞外囊泡”研究中心、基础生物医学实验中心、蛋白抗体中心和分子生物学中心为依托,提供核酸和蛋白的整体研究方案,与众多科研单位携手开展了大量的探索项目。截止到目前,已支持客户发表科研论文达1000+篇,累计影响因子6000+。
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