RNA结合蛋白免疫沉淀RIP/RIP-seq/Ago2-RI

服务介绍

RIP 技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 结合蛋白免疫沉淀）主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。RIP 是研究细胞内RNA 与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，可以帮助我们发现miRNA 的调节靶点。

根据需求，金开瑞可以提供RNA/蛋白、RNA/RNA互作验证RIP技术服务。

服务优势

• 高灵敏度和高特异性：RIP技术能够高度富集RNA和与之相互作用的蛋白质，具有较高的灵敏度和特异性

• 低样本量要求：RIP技术可以在较少的细胞或组织样本中进行实验，减少实验成本和样本需求

• 适用于多种RNA种类：RIP技术适用于不同类型的RNA研究，包括长链非编码RNA和编码RNA

• 不需要事先了解RNA-蛋白质相互作用的信息：可用于探索未知的RNA-蛋白质相互作用

• 可量化分析：RIP技术可以进行定量分析，评估不同条件下的相互作用的强度和稳定性

• 结合其他技术的联合应用：RIP技术可以与其他技术相结合，如RNA测序、蛋白质组学和转录组学等，进行综合分析，深入揭示RNA-蛋白质相互作用的功能和调控机制

 

服务流程

载体构建及转染--细胞裂解液获取--磁珠的准备--RNA结合蛋白免疫沉淀--RNA 纯化--RNA 反转录及cDNA 验证（若需测序分析请另外咨询）--数据分析及Figure制作
 

客户提供

目的蛋白抗体（可用于IP）及其说明书；

需检测的细胞样品；

目的基因、目的蛋白信息。

 

最终交付

原始数据、结果图片（包括阴性对照结果）；

标准实验报告（包括详细的材料与方法）；

SCI标准Result Figure。

服务说明

服务名称	服务内容	交付内容及标准	服务周期(工作日)
RIP-qPCR	RIP前WB	1个样本，1个抗体	20
（Protein-RNA）	RIP	富集2次：IgG、IP各1次
	RIP后WB	IgG，IP，input各1次
	qPCR	IgG，IP，input各1个泳道
Ago2-RIP	qPCR检测目的RNA 的本底表达	含miRNA过表达和对照组，每组含IgG、Ago、Input检测	28
（miRNA-RNA）	RIP	富集2次：IgG、IP各1次
	qPCR	IgG，IP，input各1个泳道

 

案例展示

相关技术服务

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相关资源

1、RIP技术的实验步骤

    ● 细胞提取：从细胞中提取总蛋白质，包括RNA结合蛋白质

    ● 免疫共沉淀：将提取的细胞蛋白质与特异性抗体结合，形成免疫复合物

    ● 沉淀：使用蛋白A/G磁珠等具有亲和性的材料，将免疫复合物沉淀下来

    ● 洗涤：通过洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白质

    ● 逆交联：将免疫复合物与RNA解离，并逆交联，释放RNA分子

    ● RNA提取：从逆交联的样品中提取RNA

    ● 分析：对提取的RNA进行定量PCR、RNA测序或其他RNA分析方法，用于鉴定与特定RNA相互作用的蛋白质

 

2、RIP技术的应用

    ● RNA调控网络的研究：RIP技术可以帮助我们揭示RNA-蛋白质相互作用在基因调控中的作用。通过鉴定与特定RNA相互作用的蛋白质，我们可以了解RNA的转录、剪接、稳定性和翻译等方面的调控机制，从而揭示RNA调控网络的复杂性和动态性。

    ● 疾病相关的RNA-蛋白质相互作用研究：RIP技术可以用于研究与疾病相关的RNA-蛋白质相互作用。通过比较疾病样本和正常样本中的RNA-蛋白质相互作用，我们可以发现与疾病发生和发展密切相关的RNA-蛋白质相互作用，从而提供新的疾病诊断和治疗靶点。

    ● 新型RNA结合蛋白质的发现：RIP技术可以帮助我们发现新的RNA结合蛋白质。通过鉴定与特定RNA相互作用的蛋白质，我们可以发现那些在传统方法中未被发现的RNA结合蛋白质，从而揭示更多未知的RNA功能和调控机制。

    ● RNA-蛋白质相互作用在药物研发中的应用：RIP技术可以在药物研发过程中发挥作用。通过研究特定药物对RNA-蛋白质相互作用的影响，我们可以评估药物的效果和安全性，为药物研发提供重要的信息和指导。

 

3、RIP实验结果不如预期如何优化

（1）低信号强度：如果RIP实验的信号强度较低，可能是由于以下原因：

     ▶ 优化抗体浓度：尝试调整抗体的浓度，增加或减少抗体的用量，以获得更好的信号与噪音比。

     ▶ 增加孵育时间：延长孵育时间可以增加目标RNA和蛋白质的结合，从而提高信号强度。

     ▶ 优化实验条件：调整反应温度、缓冲液成分等实验条件，以最大化结合效率。

 

（2）高背景噪音：如果RIP实验存在较高的背景噪音，可能需要考虑以下优化措施：

     ▶ 优化洗涤步骤：增加洗涤步骤的次数和强度，以有效去除非特异性结合物质，减少背景噪音的干扰。

     ▶ 优化抗体选择：确保选择具有较低非特异性结合能力的抗体，以减少背景信号。

     ▶ 增加阴性对照：引入适当的阴性对照，如使用非特异性抗体或非相关RNA序列，以帮助区分真实信号和背景噪音。

 

（3）非特异性结合：如果RIP实验存在非特异性结合问题，可以尝试以下优化策略：

     ▶ 优化洗涤条件：增加洗涤缓冲液的浓度和洗涤时间，以更彻底地去除非特异性结合物质。

     ▶ 使用更严格的阴性对照：选择更具特异性的阴性对照，确保它与目标RNA不存在相互作用。

     ▶ 预实验和对照实验：进行预实验和对照实验，以验证特异性结合并排除非特异性结合的影响。

 

（4）结果不一致或不可重复：如果RIP实验结果在重复实验中存在不一致或不可重复的问题，可以考虑以下优化措施：

     ▶ 增加实验重复次数：增加实验的重复次数，以提高结果的一致性和可靠性。

     ▶ 核对实验步骤：仔细核对实验步骤，确保实验操作的一致性和准确性。

     ▶ 校准实验条件：重新校准实验条件，包括反应时间、温度和孵育条件等，以确保实验的可重复性。