真核转录组测序

概述

转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的必然纽带。真核mRNA测序是基于HiSeq平台，对真核生物特定组织或细胞在某个时期转录出来的所有mRNA进行测序。既可研究已知基因，亦能发掘新基因，全面快速获得mRNA序列和丰度信息。还用于研究基因结构和基因功能、可变剪接和新转录本预测等。转录组研究已经成为揭示生物生长发育调控、逆境胁迫和抗病反应机制的最佳研究手段。真核mRNA测序方法可分为：有参考转录组、无参考转录组及数字基因表达谱（DGE）三大类。

应用

1、环境转录组学;2、发育转录组;3、遗传转录组;4、比较转录组;5、互做转录组学。
技术流程

样本要求

样本类型：去蛋白并经过Dnase处理的总RNA;
RNA样本量：≥5.0 μg
RNA浓度： ≥200 ng/μL
RNA纯度： OD_260/280=1.8-2.2，OD_260/230 ≥2.0；
动物样本：RIN ≥7.0，植物样本：RIN ≥6.5，28S：18S ≥1.0

策略

常见问题

Q 转录组测序的技术重复性很高，那是否还有必要设生物学重复？
有必要，至少需要两次生物学重复，3次以上的生物学重复更好。2011年7月Hansen发表的文章表明生物学差异是基因自身表达的特性，与检测技术的选择以及数据处理的方式无关。如果不设生物学重复，高影响因子的杂志可能会因此而拒稿。
Q 转录组测序详细的样本要求是怎样的？

	合格	不合格(建库有风险)
RNA	1. OD260/280≧1.8 2. 28S/18S≧1 （植物参考25S/18S;原核参考23S/16S;特殊样品只有18S可不参考） 真核：总量≧1μg（单次建库），浓度≧50ng/μl 原核：总量≧3μg（单次建库），浓度≧65ng/μl 植物、真菌 RIN值≧6.5 动物 RIN值≧7.0 原核 RIN值≧6.0 （特殊物种，如没有28S，可以不参考，但Agilent 2100 图的基线要平整，RIN值最好可以达到7.0）	N/A 真核：总量 <1μg 原核：总量 <3μg RIN值 <7.0

注：1、如果样品OD值未达到要求：可能影响转录组建库时磁珠分离mRNA及反转录效率；可能对基因定量和文库随机性有轻微影响，导致duplication比例高。
2、基因组注释：基因预测、功能基因注释（与Nt、Nr、Swiss-Prot、Interpro等数据进行同源比对）、重复序列分析及Non-coding RNA注释等。
3、基因功能分析：包括GO富集分析、KEGG通路分析等。
4、比较基因组学及进化分析：通过比较相近物种的基因组数据，从基因功能、基因组骨架结构、分子进化等方面对目标物种基因组进行深入分析）。