全基因组denovo测序

概述

全基因组从头测序 （De Novo Sequencing）在没有参考基因组的情况下对某物种的全基因组进行测序和组装，从而绘制该物种的全基因组序列图谱。随着测序技术的发展，测序成本和测序时间大大降低，全基因组从头测序已经成为快速了解该物种的一个重要途径。尤其与人类生存相关的物种，如水稻、玉米、棉花等基因图谱的绘制完成，标志着我们可以从基因组水平对这些物种的生长、发育、进化、起源等问题进行研究，从而对基础生物学、分子育种、遗传基因改良等方面的研究起到巨大的推动作用。

应用

1、比较基因组学研究，揭示物种及功能进化；
2、有参物质de novo 组装，精心挖掘特有变异。

技术流程

样本要求

样本类型：无降解，无RNA污染的DNA样品
样本纯度：OD_260/280=1.8~2.0
样本总量：所有建库用DNA样本均来源于同一个体，不同文库的样本浓度及DNA需求量不一。
注：所有建库用DNA样本均来源于同一个体，不同文库的样本浓度及DNA需求量不一。
1）样品需求量：小片段文库≥1 µg；2 Kb~6 Kb大片段文库≥20 µg；10 Kb大片段文库≥30 µg；20 Kb和40 Kb大片段文库≥60 µg；完成全基因组测序样品DNA量需求约为500 µg~1 mg；
2）样品浓度：小片段文库≥30 ng/µl，大片段文库≥133ng/µl；
3）样品质量：基因组完整。如需建立≥5 Kb的插入片段文库，要求普通琼脂糖电泳（推荐用0.6%凝胶，选用λ-HindIII digest或其它具有20Kb以上条带的ladder，80-120V电泳40-60min）结果，基因组DNA主带应在λ-HindIII digest最大条带23Kb以上，若有脉冲场电泳结果，则DNA主带应在40 Kb以上；
4）若提供组织样品，则植物样本需为无菌黄化苗、组培样品或嫩叶；动物样本为肌肉、血液等脂肪含量较少的组织。尽量选择同一个体取样，以减少个体差异性对后续拼接的影响。

策略

测序平台:HiSeq PE150
文库：300bp/500bp/2kb/5kb/10kb/20kb文库

测序深度

50X

常见问题

Q 动物基因组测序对样品取样有什么特殊要求?
样品提取应选用肌肉、血液等脂肪含量较少的部位,并尽量选用同一个体进行取样。如果物种体积较小，单个个体所提取的 DNA 量不足一次测序反应,在保证量的情况下，应 当尽量减少物种的个数，以减少个体差异性对后续拼接的影响。样品建议采用纯合体材料。
Q 全基因组de novo测序的具体生信分析有那些？
1、基因组拼接组装统计：原始数据统计、测序覆盖度统计Contig N50大小、基因组GC含量等信息。
2、基因组注释：基因预测、功能基因注释（与Nt、Nr、Swiss-Prot、Interpro等数据进行同源比对）、重复序列分析及Non-coding RNA注释等。
3、基因功能分析：包括GO富集分析、KEGG通路分析等。
4、比较基因组学及进化分析：通过比较相近物种的基因组数据，从基因功能、基因组骨架结构、分子进化等方面对目标物种基因组进行深入分析）。