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真核有参转录组测序是基于已知参考基因组或转录组的物种，通过高通量测序技术全面分析基因表达水平、可变剪切、融合基因等分子特征的技术。
一、实验流程
1. 样本准备与RNA提取
- 样本类型：组织、细胞、血液等（需避免降解）。
- RNA提取：使用试剂盒（如TRIzol）提取总RNA，检测纯度（OD260/280 ≥1.8）、浓度及完整性（RIN值 ≥7，Agilent Bioanalyzer）。
2. 文库构建与测序
- mRNA富集：用oligo(dT)磁珠捕获真核生物polyA尾mRNA（适用于完整RNA）。
- 链特异性建库：片段化后合成cDNA，添加测序接头（如Illumina TruSeq）。
- 测序平台：Illumina NovaSeq/HiSeq（主流），PE150双端测序，推荐数据量6-12 Gb/样本。
3. 质控环节
- RNA质检（Qubit、Bioanalyzer）、文库质检（Qubit、qPCR）、测序数据质控（FastQC评估）。
二、分析内容
1. 基础分析
- 数据质控：FastQC检查原始数据，Trimmomatic过滤低质量reads。
- 序列比对：Hisat2/STAR将reads比对到参考基因组。
- 基因定量：StringTie/featureCounts计算基因/转录本表达量（FPKM/TPM）。
2. 核心分析
- 差异表达分析：DESeq2/edgeR筛选差异基因（阈值：|log2FC|>1，p<0.05）。
- 功能注释与富集：GO、KEGG、Reactome等数据库注释，ClusterProfiler进行富集分析。
- 可变剪切分析：rMATS/MISO检测差异可变剪切事件。
3. 高级分析
- 融合基因检测：STAR-Fusion/Arriba分析基因融合事件。
- SNP/INDEL分析：GATK检测RNA水平的突变。
- 共表达网络：WGCNA挖掘基因模块与表型的关联。
4. 数据交付
- 原始数据（fastq）、表达矩阵、差异基因列表、可视化图表（火山图、热图、通路图等）。
三、应用方向
1. 基因表达调控
- 比较不同条件（疾病vs正常、处理vs对照）的差异表达基因，揭示调控机制。
2. 疾病机制研究
- 癌症、神经退行性疾病等关键基因筛选（如肿瘤标志物发现）。
3. 发育与分化研究
- 追踪胚胎发育、干细胞分化的动态表达变化。
4. 药物研发
- 药物靶点筛选、毒理评估（如药物处理后的基因表达扰动）。
5. 分子标记开发
- 基于差异基因开发诊断或预后生物标志物（如血液肿瘤分型）。
6. 环境响应
- 研究生物对胁迫（高温、重金属）的转录响应。
7. 进化与比较基因组学
- 跨物种比较基因表达差异，解析进化机制。
四、技术优势
- 高灵敏度：可检测低丰度转录本。
- 多维度分析：整合表达量、突变、可变剪切等多层信息。
- 个性化定制：根据需求扩展分析（如LncRNA、circRNA研究）。
适用物种：人类、小鼠、拟南芥等基因组注释完善的物种。
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