AAV在肺部中的应用

AAV在肺部的递送及表达
目前对于肺部的病毒感染，普遍采用AAV病毒载体。虽然AAV1，5，6，9几个血清型均有报道能实现肺部表达，但是AAV9在肺部的表达最强。一般递送途径包括两类：系统注射（经血液循环）、鼻内或气管内递送（经呼吸道）。系统注射会同时感染其他脏器，病毒被稀释，使得靶向肺脏的病毒减少，因此一般对于肺脏的特异性感染，都是采用呼吸道递送。鼻内递送直接使用微型移液器推送，参考剂量是1×1011vg病毒，体积50ul。气管内递送则使用24G的导管将病毒液体推送到气管内，剂量同鼻内递送。通过肺呼吸道递送，可以实现最大程度的特异性递送，并实现肺部的高效表达，同时降低病毒剂量（图1）。
使用病毒载体的一个不可忽略的问题就是免疫反应。尽管AAV的免疫原性相对较低，但是对于二次免疫，其免疫反应也会非常显著，并且不同血清型的AAV产生免疫反应的程度不一样。相对来说，AAV9产生的免疫反应较小，且鼻内递送病毒因为几乎没有体液反应，可以考虑二次递送。
肺部特异性表达对启动子一般没有特别要求，像CMV、CAG等在肺部中表达均很好。实验中可以通过上述特殊的递送方法实现在肺部的特异性表达。

AAV介导CRISPR/Cas9在肺部的应用
通过CRISPR/Cas9系统能够快速获得各种基因敲除小鼠模型。由于该技术能够同时靶向多个DNA位点，因此在肺部可以借助AAV9载体递送sgRNA，再结合含Cas9基因的knock-in小鼠，可以快速建立肺部特异性敲除小鼠模型。
以下简要分享张锋团队利用CRISPR/Cas9的Knock-in小鼠和AAV载体递送的sgRNA靶向小鼠肺部，实现肺部基因的特异性敲除，并成功诱发肿瘤（图2）。
上述AAV表达载体含有3个不同基因的sgRNA，可以同时失活3个基因。同时该载体表达Cre重组酶，能够诱导被感染的细胞激活Cas9的表达（图3）。
AAV9的感染效率与受体改造
AAV9对多种器官组织具有较高的感染倾向性，包括心脏、肌肉、肺以及神经等。很多病毒的感染入侵都依赖于特定的糖基化修饰。因此，研究人员对糖链分析后发现，通过神经氨酸酶（Neuraminidase）消化去除末端的唾液酸后，AAV9感染能力显著加强。而且，对肌肉、心脏和肝脏半乳糖水平的研究发现，AAV9对组织的感染效率与半乳糖的表达水平呈负相关：组织半乳糖表达越高，AAV9感染越低；组织中半乳糖水平越低，AAV9的感染水平越高。通过神经氨酸酶消化细胞表面的唾液酸基团后，能够增强AAV9对肺部组织的感染效率（图4-6）。
现在有很多实验室都在尝试对决定AAV血清型的衣壳蛋白进行改造，以达到增强AAV对某一特定组织高效感染的目的。另外，不同实验室采用的病毒包装体系和包装细胞不同，这些诸多因素使得不同研究中的结果往往出现差异。但是普遍的结论认为，通过尾静脉等系统注射，AAV9在心脏表达最高，其次为肌肉和肺部。肝脏感染的效果，不同研究中差别很大。一方面取决于启动子以及表达的靶基因本身；另一方面有些实验在注射过程中造成血管损伤后，肝脏会出现较高的表达，不过经检测发现，AAV9递送基因在肝脏中的表达没有在心脏和肌肉中持久。和元生物在AAV血清型方面的改造具有丰富的实践经验，致力于研发出组织特异性强的AAV血清型，为广大科研客户提供精准性高的AAV载体。