CRISPR/Cas9单克隆敲除株/敲除细胞株构建/敲除株构

非编码RNA研究及实验

对lncRNA设计干扰片段，再将该片段构建入病毒载体中。该载体除了可以直接瞬时转染细胞用于lncRNA的干扰，也可以包装成慢病毒，用于动物水平干扰lncRNA。 lncRNA敲除：用CRISPR/Cas9技术对lncRNA进行敲除。针对lncRNA某条片段的两端分别设计多条sgRNA序列，实现大片段删除，从而达到敲除的效果。将sgRNA序列构建入病毒载体中，再将Cas9序列装入另一载体中，随后两种病毒同时感染目的细胞进行敲除。 lncRNA靶基因寻找：方法基本类似于上面表述的miRNA双荧光

CRISPR 技术进行细胞 TP53 基因敲除

实验原理 TP53 是重要的抑癌基因。在多种肿瘤中都能发现 TP53 基因突变及功能丧失。我们将针对 TP53 基因设计的靶点构建到 pCas9/gRNA1 载体，转染 293T 细胞，构建了 TP53 基因敲除 293T 细胞系。 1、本实验基因敲除原理：pCas9/gRNA1 载体表达 gRNA 和 Cas9 蛋白。将靶点序列克隆到 pCas9/gRNA1 载体上，gRNA 将诱导 Cas9 蛋白对靶点 DNA 进行切割，造成 DNA 断裂。细胞通过邻端连接

基因递送的多面手：慢病毒载体

目前慢病毒载体主要应用在以下几个方面： 细胞基因治疗（截止目前，已上市的 CAR-T 产品有 9 款采用了慢病毒载体递送 CAR 基因） 基因表达调控（过表达、RNA 干扰研究等） 基因编辑（CRlSPR/Cas9 gRNA 文库筛选、基因敲除、敲入、点突变、基因激活/抑制） 稳转细胞株构建 活体细胞成像追踪 转基因动物 图 1 慢病毒载体的主要应用方向   应用案例   案例 1：用慢病毒载体进行基因过表达，构建稳转细胞株，研究葡萄糖激酶在前列腺癌（PCa）中的作用[1] 细胞