酵母双杂交文库筛选（核体系或膜体系）

酵母双杂交文库筛选（核体系或膜体系）

 

 

▼服务简介

 

  酵母双杂交筛库的实验思路是以诱饵载体，筛选酵母双杂交文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定互作蛋白。

 

▼应用场景

 

  最有价值的应用是用BD-X筛选由AD-Y构成的cDNA文库，以获得新的蛋白质之间的相互作用，并分析研究新的基因。用于鉴定新的蛋白质相互作用，证实可疑的相互作用，确定相互作用的结构域，且可直接获得编码相互作用的蛋白的基因。

 

▼实验原理

 

  酵母双杂交系统是在酵母体内通过重建有活性转录因子的结构来鉴定蛋白质之间的相互作用。转录因子可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录。这种DNA结合与转录激活的功能是由转录因子上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(Binding Domain, BD)和转录激活结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录激活都是必须的。在GAL4系统中利用转录因子GAL4的DNA结合结构域GAL4-BD与激活结构域GAL4-AD的特异载体，分别与基因的ORFs融合，转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若发生相互作用时，就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起，从而与上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)结合，激活相应报告基因的表达，在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。酵母双杂交文库的构建是筛库的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大规模筛选分析蛋白质间的相互作用，是现在分子生物学与生物化学常用的手段。

 

▼服务内容

 

 

▼案例展示

 

▼常见问题

 

  1.Clontech文库是否可行？

  clontech和invitrogen体系是两家公司的产品，分别用的是SMART和Gateway重组方法。判定文库质量有3个标准，库容，重组率，平均插入片段大小。clontech体系存在很多技术上的弊端，现在已经慢慢被淘汰了。比如合成cDNA第二链时用的是PCR方法，一个物种一般有几万个基因，用一种酶把几万个基因全部扩增到是很难实现的，就像我们平时克隆一个基因经常出现有的酶可以PCR扩增到，有的酶扩不到。而且PCR循环数越多，高拷贝和易扩增的基因冗余度越高，低拷贝和不易扩增的基因慢慢就会丢失，所以很难反映一个物种中基因的真实情况。而invitrogen体系在合成cDNA第二链时是以第一链为模板，通过E.coli.DNA Ligase，E.coli.DNA Polymerase I，T4 DNA Polymerase 等不同酶扩增，能够忠实反映第一链的情况，也就是能够忠实反映mRNA的情况，保证mRNA没有降解，文库构建已经成功一半了。不会造成基因冗余和不均一化的情况。另外由于clontech合成cDNA第二链是PCR的方法，PCR扩增的局限性导致平均插入片段长度较短，一般在500bp左右，这500bp可能包括一部分CDS和UTR，甚至全部都是UTR。如果筛库筛到了，可能就是假阳性，完全没有编码蛋白。invitrogen体系平均插入片段大于1kb，大大减少了全部是UTR的状况，降低了假阳性。clontech体系是线性化质粒一步重组，而invitrogen体系是环装质粒两步重组，线性化质粒的重组率是低于环装质粒的，所以clontech建库后会发现空载率比较高。而环装质粒重组效率高，另外在质粒上加了致死基因，空质粒不会在大肠DH10B中生长，大大降低了空质粒情况。综上，invitrogen体系在库容，重组率，平均插入片段大小方面表现都是优于clontech体系。

  2.为什么有的clontech体系平均插入片段大于1kb？

  正常做是不容易达到的，因为PCR第二链会导致片段小。在cDNA分级分离这一步不采用过柱的方法，直接跑胶切下1kb或1.5kb以上的片段往下重组。这种方法提高了片段大小，但是降低了库容。而invitrogen体系不需要这么做，片段较大，直接过柱除去大部分400-500bp小片段就可以了。

  3.酵母双杂交筛库用三缺是否可行？

  空AD和空BD质粒共转三缺都会长克隆，这么做筛库会造成很高的假阳性。不过确实可以光速交付结果。

  4.酵母单杂交筛库高通量测序是否可行？

  酵母单杂交筛库长出的单克隆，正常操作是直接PCR，单条带且片段较大的送测序。多条带的一般舍弃不用，无法确定哪个是结合蛋白，同时作用还是单独作用（通过划线分离出单条带的单克隆是可行的，但是很繁琐，单杂长的克隆较多，一般没必要在多条带的单克隆上纠结）。而高通量测序无法分辨测序结果是单条带或多条带的单克隆，继而造成假阳性偏高。