载体质粒构建| 载体构建| 亚克隆载体构建服务| 质粒载体构

相关技术服务

定点突变

基因合成

RNA合成

DNA测序

引物合成

双荧光素酶报告系统

相关资源

1、亚克隆实验步骤及注意事项

（1）实验步骤

①　DNA片段制备：

    ● 确保选择正确的酶切酶和缓冲液，以确保准确的酶切反应。

    ● 根据实验需求，选择适当的酶切时间和温度。

    ● 注意避免DNA片段污染和降解，使用无菌和无核酸酶的实验操作。

②　载体DNA准备：

    ● 确保载体DNA质量高，无降解和污染。

    ● 使用正确的酶切酶和缓冲液，以确保正确的酶切反应。

    ● 注意选择正确的酶切时间和温度，以避免过度酶切或不完全酶切。

③　连接反应：

    ● 根据需要，选择适当的连接酶和缓冲液，并按照推荐的酶和DNA比例进行反应。

    ● 确保反应温度和时间适宜，以获得高效的连接效果。

    ● 考虑使用阳性和阴性对照进行验证连接反应的成功与否。

④　转化：

    ● 根据实验目的选择合适的转化方法（如化学转化、电穿孔等）。

    ● 严格控制转化条件，包括细胞的生长状态、转化时间和DNA的浓度等。

    ● 根据不同细胞类型的要求，选择合适的培养基和培养条件。

⑤　筛选与鉴定：

    ● 根据实验设计，使用适当的筛选标记（如抗生素抗性基因）进行转化子的筛选。

    ● 进行PCR扩增和测序分析，以确认所获得的克隆是否包含目标DNA序列。

    ● 进行限制性酶切鉴定或其他分子生物学方法，验证重组DNA的准确性和完整性。

（2）注意事项：

    ● 严格遵守实验室的安全操作规范，使用无菌和无核酸酶的实验操作。

    ● 注意实验中的温度、时间、酶切酶和缓冲液的选择，以确保反应的准确性和高效性。

    ● 使用正确的阳性和阴性对照，确保实验结果的可靠性。

    ● 在转化和筛选过程中，注意细胞的生长状态和培养条件，以确保转化效率和克隆的存活率.

2、不同转化方法的简介及优劣势对比

转化方法	简介	优势	劣势	示例
热激转化法	利用高温冲击使细胞膜通透，导入外源DNA	简单易行，适用于多种微生物	转化效率较低，可能对细胞产生损伤	将外源DNA加入大肠杆菌中进行转化
电穿孔法	通过电场脉冲使细胞膜形成孔隙，使DNA进入细胞	适用于多种细胞类型，转化效率高	需要专门设备，可能对细胞产生损伤	用电穿孔仪对哺乳动物细胞进行转化
钙离子共沉淀法	利用钙离子和DNA共同沉淀，通过吸附实现转化	操作简单，适用于多种细胞类型	转化效率相对较低，需要特定缓冲液	用钙离子法将DNA转化至昆虫细胞
脂质体转染法	利用脂质体封装外源DNA，与细胞膜融合实现转化	适用于多种细胞类型，转化效率高	成本较高，复杂操作步骤	使用脂质体转染法将DNA转化至培养的哺乳动物细胞
生物素化转染法	利用生物素化技术将DNA与生物素结合，与目标细胞特异性结合实现转化	可实现细胞特异性转化，转化效率较高	增加实验成本，结合稳定性需考虑	利用生物素化转染法将DNA转化至特定细胞亚群
离子转染法	利用离子的作用使细胞膜通透性增加，使DNA进入细胞	适用于多种细胞类型，转化效率较高	需要优化离子条件，离子毒性问题	利用离子转染法将DNA转化至植物细胞

常用的载体验证方法

    ● 酶切鉴定：通过对构建的载体进行限制酶切消化，验证目标基因是否正确插入载体。将载体与适当的限制酶一起切割，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，观察目标片段的出现。

    ● PCR验证：使用引物对构建的载体进行PCR扩增，检测目标基因的存在。通过设计引物，可选择性扩增目标基因片段，并通过琼脂糖凝胶电泳分析确认扩增产物的大小。

    ● DNA测序：进行构建的载体进行全序列或部分序列测序，以验证目标基因的正确性和序列准确性。通过与设计的序列进行比对，确认插入的目标基因是否与预期一致。

    ● 蛋白质表达验证：将构建的载体转化至适当的宿主细胞中，并通过蛋白质表达分析确认目标基因的蛋白质表达情况。可通过Western blot、ELISA等方法检测目标蛋白质的表达水平和纯度。

    ● 功能性验证：根据载体的功能设计相应的实验验证。例如，如果载体是用于表达蛋白质的，可以通过功能性分析，如酶活性测定、细胞增殖或细胞凋亡实验等，验证目标基因的功能。

    以上方法可以单独或结合使用，以确保构建的重组载体的正确性和功能性。在进行载体验证时，注意选择合适的实验方法和控制组，严格操作实验步骤，以获得可靠的结果。

金开瑞-提供核酸和蛋白的整体研究方案：

武汉金开瑞生物工程有限公司是一家专业致力于为全球制药企业、诊断试剂企业、科研试剂研发企业、高校和科研院所以及大型医院提供蛋白及相关研究技术服务的高新技术企业。金开瑞极其注重平台技术提升，现已有多项自主知识产权和软件著作权专利，并已通过ISO9001质量管理体系认证，2018获批“千企万人”支持计划。公司以“细胞外囊泡”研究中心、基础生物医学实验中心、蛋白抗体中心和分子生物学中心为依托，提供核酸和蛋白的整体研究方案，与众多科研单位携手开展了大量的探索项目。截止到目前，已支持客户发表科研论文达1000+篇，累计影响因子6000+。
 

检测分析平台——免疫学、细胞系、分子生物学检测、双荧光素酶报告基因；
基因服务平台——引物合成、基因合成、DNA提取、载体构建、定点突变；
分子互作研究平台——双萤光素酶报告系统、RNA pull down、RIP/RIP-seq、EMSA等；
蛋白表达平台——提供从基因合成到蛋白表达的一站式服务；
抗体定制平台——单/多克隆抗体、人源化抗体、基因工程抗体、双特异性抗体、修饰抗体、诊断抗体、小分子抗体、抗体对、噬菌体服务。

更多服务内容及优惠活动，详见公司主页：http://www.genecreate.cn/