Brdu 5-溴-2'-脱氧尿苷检测试剂盒

Brdu 5-溴-2'-脱氧尿苷检测试剂盒 

产品简介：

BrdU（5-Bromo-2-deoxyUridine），即5-溴脱氧尿嘧啶核苷，是胸腺嘧啶核苷（T）类似物，可以通过竞争替代T掺入DNA合成（S期）。活体注射或细胞培养时加入BrdU，而后利用抗BrdU抗体和抗体连接酶或荧光素作为指示系统，当处于旺盛分裂的细胞掺入BrdU后，即可检测出含有BrdU的细胞，并以此判断合成细胞的数目。同时结合其它细胞标记物双重染色，可判断出增殖细胞的种类，增殖速度等，对研究细胞动力学有重要意义。BrdU掺入定位准确，阳性结果表达了S期细胞新合成DNA的水平，而且受细胞内外环境影响小，标记不会丢失。本产品适用于各种细胞和组织切片的细胞增殖检测。

包装内容：

产品货号	产品名称	规格	保存方式
WB4102-1	破膜液	30ml	4℃保存6个月
WB 4102-2	封闭液	30ml	4℃保存6个月
WB 4102-3	4%多聚甲全	30ml	常温保存6个月
WB 4102-4	1M Hcl	30ml	4℃保存6个月
WB 4102-5	Anti-BrdU（mouse mAb）	50ul	-20℃保存12个月

注意事项：

1、本试剂盒试剂如经常使用可按上表的保存方式保存。如长期不用，可放-20℃保存。

2、BrdU的浓度和处理时间与细胞种类有关。肿瘤细胞需要的浓度和时间都较低，成纤维细胞或上皮细胞等增殖较慢的细胞需要提高浓度并延长作用时间，浓度范围为20--100 uM，作用时间为40 min--4h ，可根据细胞的种类进行调整。

下表为测试的常用细胞处理浓度及时间，仅供参考。

细胞名称	Brdu浓度（uM）	孵育时间（min）
A549	40	40
Hela	40	40
NRK-52e	40	40
Skov3	80	120
H9C2	40	40

3、为保证最佳实验效果，建议使用本公司生产的其他配套试剂：4%多聚甲全（WB 1101）；苏木素染液（WB 1004）；DAPI染液（WB 1012）；二抗；DAB显色试剂盒（WB 1211），抗荧光淬灭封片剂（WB 1401）。

 

BrdU免疫组化(免疫荧光)操作说明

 

• 细胞爬片标本BrdU免疫组化(免疫荧光)操作步骤：

将盖玻片用洗洁剂清洗干净，泡在75%的酒精中静置10min。然后在酒精灯上将酒精烧干，将烧干的盖玻片放在六孔板中，待冷却后将细胞悬液（约1-2×10⁴个细胞）滴加在盖玻片上。5h后轻轻补加1ml培养基，置37℃ 5%CO₂ 培养箱中培养过一夜。待细胞贴在玻片上良好生长后每孔避光加入1 ml 含有BrdU的培养基(BrdU的具体浓度见注意事项)，于培养箱中孵育40 min后即可。

1. 将上述处理好的细胞爬片用PBS洗3次，加4%的多聚甲全溶液（WB 1101）处理30 min。PBS洗3次，每次5min；
2. 滴加破膜液处理10min，PBS洗3次，每次5min；
3. 加苏木素染液（WB 1004）室温染5min，用PBS洗3次，每次5min；（免疫荧光加DAPI染液（WB 1012）染5min，用PBS洗3次，每次5min。）
4. 爬片滴加4%多聚甲全处理10min，然后用PBS洗3次，每次5min；
5. 爬片滴加1M Hcl，37℃处理30min，然后用PBS稍洗；
6. 重复步骤4，将切片滴加4%多聚甲全处理10min，然后用PBS洗3次，每次5min；
7. 将爬片滴加封闭液3%BSA处理30min后稍甩干；
8. 用封闭液3%BSA按1︰100稀释Anti-BrdU（mouse mAb），配制成一抗工作液，现用现配。
9. 滴加稀释好的一抗工作液，4℃孵育过一夜；
10. 爬片复温至室温后冲洗掉一抗工作液，PBS洗3次，每次5min；
11. 在爬片上滴加HRP标记的二抗（建议使用此二抗，可向我司订购，货号：WB 1210-2-A），室温孵育1h；(免疫荧光步骤不加HRP标记的二抗，改为滴加用PBS按1︰100稀释的anti-mouse IgG荧光二抗，室温避光孵育1h。)
12. 冲洗掉二抗，PBS洗3次，每次5min；（免疫荧光步骤此部分需要避光）
13. DAB显色（WB 1211），脱水，透明，封片，即可在显微镜下观察。（免疫荧光不用DAB显色，直接加抗荧光淬灭封片剂（WB 1401）封片，即刻在显微镜下观察。）

 

NRK-52e细胞标记BrdU（红光）, DAPI(WB 1012)染核，二抗用Cy3标记的山羊抗小鼠（WB B21301）。

 

• BrdU体内标记及石蜡切片免疫组化（免疫荧光）步骤：

取实验动物，按照BrdU 50mg/kg的浓度，腹腔注射给药。共4次，每次间隔2小时，最后一次给药24小时后，处死动物。

将组织常规脱水包埋后做石蜡切片后进行免疫组化检测。

1. 石蜡切片依次经二甲苯和梯度酒精脱蜡至水；
2. 将切片放入盛有抗原修复液的修复盒内进行微波抗原修 复，中火至沸后断电间隔10min，再低火至沸，断电后自然冷却至室温；
3. 加入苏木素染液（WB 1004）染5min；（免疫荧光用DAPI染液（WB 1012）染5min，用PBS洗3次，每次5min；）
4. 将切片放入4%多聚甲全中10min，然后用PBS洗3次，每次5min；
5. 滴加1M Hcl后，37℃处理30min，用PBS稍洗；
6. 重复4步骤，将切片放入4%多聚甲全中10min，然后用PBS洗3次，每次5min；
7. 3%双羊水封闭25min，然后用PBS洗3次，每次5min；（免疫荧光不用此步骤。）
8. 滴加封闭液3%BSA，室温处理30min后稍甩干；
9. 用封闭液3%BSA按1︰100稀释Anti-BrdU（mouse mAb），配制成一抗工作液，现用现配。
10. 滴加稀释好的一抗工作液，4℃孵育过一夜
11. 切片复温至室温后，冲洗掉一抗工作液，PBS洗3次，每次5min；
12. 在爬片上滴加HRP标记的二抗（建议使用此二抗，可向我司订购，货号：WB 1210-2-A），室温孵育1h；（免疫荧光用PBS按1︰300稀释的anti-mouse IgG荧光二抗(可向我司订购)，室温避光孵育1h；）
13. 冲洗掉二抗，PBS洗3次，每次5min；（免疫荧光步骤此部分需要避光）
14. DAB显色（WB 1211），脱水，透明，封片，即可在显微镜下观察。（免疫荧光不用DAB显色，直接加抗荧光淬灭封片剂（WB 1401）封片，即刻在显微镜下观察。）

 

 

大鼠肠组织标记BrdU，DAB显色。