活体细胞线粒体损伤/氧化（NAO）荧光测定试剂盒

活体细胞线粒体损伤/氧化荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

活体细胞线粒体损伤/氧化荧光测定试剂是一种旨在通过特异性染色剂分析线粒体膜心磷脂的变化来定性或定量测定线粒体内含质量以及自由基、氧化物等对细胞线粒体的毒性与损伤作用的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。

技术背景

心磷脂（Cardiolipin）是线粒体膜上的主要成分之一。它对细胞氧化特别敏感。线粒体脂类分解，致使心磷脂显著减少，最终造成线粒体的严重损害。Nonyl-Acrydine Orange（NAO）是一种可自由通过细胞膜的染色剂，特异性地染色线粒体上的心磷脂，并发出荧光。一旦线粒体膜质量减少或受到损害以及被氧化，其荧光显著减弱。

产品内容

清理液（Reagent A） 毫升
染色液（Reagent B） 微升
稀释液（Reagent C） 毫升
保存液（Reagent D） 毫升
产品说明书 1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

胰蛋白酶乙二an四乙酸混合液（YD12024）：用于细胞脱离
完全细胞培养液（YD12052）：用于细胞操作所需的培养基
15毫升锥形离心管：用于细胞操作的容器
1.5毫升离心管：用于细胞染色的容器
血细胞计数仪：用于细胞计数
台式离心机：用于沉淀细胞
细胞流式仪：用于细胞荧光分析
比色皿：用于细胞荧光分析的容器
荧光显微镜：用于观察荧光细胞
荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于细胞荧光定量分析

实验步骤

• 脱离或悬浮细胞分析

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（Reagent C），混匀后，将染色工作液置入暗室里。同时开启荧光显微镜或荧光光度仪。然后进行下列操作。

1. 准备1瓶25cm²细胞培养瓶的待测细胞（约1 X 10⁶细胞）
2. 小心抽去细胞培养液
3. 加入xx毫升 清理液（Reagent A）到细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面
4. 小心抽去清理液（Reagent A）
5. 加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二an四乙酸混合液，铺满整个培养瓶表面
6. 置入37℃培养箱1分种
7. 震动培养瓶，使细胞脱落
8. 加入4毫升用户自备的完全细胞培养液
9. 移入到15毫升锥形离心管，充分混匀（注意：悬浮细胞可以从这一步骤开始）
10. 移取10微升在血细胞计数仪上进行细胞计数
11. 移出1 X 10⁶细胞到新的15毫升锥形离心管
12. 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
13. 小心抽去上清液
14. 加入xx毫升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液，轻柔混匀
15. 放进37℃恒温水槽孵育20分钟，避免光照
16. 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
17. 小心抽去上清液
18. 加入预冷的xx微升保存液（Reagent D），轻柔混匀细胞颗粒群
19. 放进冰槽里
20. 即刻进行细胞流式仪分析（选择下列其中一种）：

（A）波长580nm（红光），观察50000个细胞以上
波峰左移，表明线粒体受到损害或被氧化，活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）
（B）波长488nm（绿光），观察50000个细胞以上
波峰左移或降低，表明线粒体受到损害或被氧化，活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）

21. 或使用荧光显微镜观察（定性检测）：

1. 移出50微升在载玻片上
2. 即刻进行载玻片压片（选择下列其中一种）

（A）激发波长580nm，散发波长630nm
红光减弱，表明活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）
（B）激发波长495nm，散发波长519nm
绿光减弱或降低，表明活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）

22. 或使用荧光分光光度仪

1. 移取400微升染色后的细胞样品到用户自备的1毫升比色皿
2. 加入xx微升保存液（Reagent D）
3. 上下倾倒混匀
4. 即刻放进荧光分光光度仪测读：滤波器激发波长580nm，散发波长630nm或滤波器激发波长495nm，散发波长519nm：活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）――相对荧光单位（RFU）降低

二、贴壁细胞分析（荧光酶标仪法定量分析）

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）在室温下融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx毫升稀释液（Reagent C）到新的15毫升锥形离心管，加入xx微升染色液（Reagent B），混匀后，在室温下静置，并标记为染色工作液，放在暗室里。同时开启荧光酶标仪。然后进行下列操作。

1. 从细胞培养箱里取出待测的96孔细胞培养板
2. 小心抽去每孔中的培养液
3. 小心加入xx微升清理液（Reagent A）到96孔板中每一个孔里
4. 小心抽去每孔中的清理液（Reagent A）（注意：确保培养孔中无任何液体残留）
5. 小心加入xx微升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液到96孔板中每一个孔里
6. 放进37℃培养箱里，孵育20分钟
7. 小心抽去每孔中的染色工作液（注意：确保培养孔中无任何液体残留）
8. 小心加入xx微升清理液（Reagent A）到96孔板中每一个孔里
9. 放进荧光酶标仪测读：滤波器激发波长580nm，散发波长630nm或滤波器激发波长495nm，散发波长519nm：活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）――相对荧光单位（RFU）降低

三、切片染色分析

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（Reagent C），混匀后，将染色工作液置入暗室里。同时开启荧光显微镜。然后进行下列操作。

1． 准备1个待测的切片样品

2. 小心加上xx微升清理液（Reagent A），覆盖切片表面
3. 小心移去切片上的清理液（Reagent A）
4. 小心加上xx微升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液，覆盖切片表面
5. 放进37℃细胞培养箱里孵育20分钟
6. 小心移去切片上的染色液
7. 小心加上xx微升新鲜的清理液（Reagent A）
8. 小心移去清理液（Reagent A）
9. 盖上盖玻片
10. 即刻在荧光显微镜下进行观察：（选择下列其中一种）

（A）激发波长580nm，散发波长630nm
红光减弱，表明活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）
（B）激发波长495nm，散发波长519nm
绿光减弱或降低，表明活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）

注意事项

1. 本产品为400次（4个96孔板）、200次（200个切片）或20次操作（1毫升处理液）
2. 操作时，须戴手套
3. 染色剂可以自由进入细胞
4. 孵育时，必须避免光照
5. 建议细胞染色完成后，即刻进行细胞流式仪分析
6. 红光检测具有特异性，而绿光检测线粒体质量变化
7. 细胞流式仪分析细胞检测量不得少于10000个
8. 荧光波长带宽为±20
9. 如果出现红光或绿光增强或右移，可能出现染料与胞浆内脂类物质非特异性结合，因此根据不同细胞类型，调整染色工作液的使用剂量（1：100至1：1000容量比），避免过度染色，干扰检测
10. 本公司提供系列线粒体分析试剂产品

质量标准

1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定荧光清晰

使用承诺

上海羽哚生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。