纯化线粒体损伤/氧化（NAO）荧光测定试剂盒

纯化线粒体损伤/氧化荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

纯化线粒体损伤/氧化荧光测定试剂是一种旨在通过特异性染色剂分析纯化线粒体膜心磷脂的变化来定性或定量测定线粒体内含质量以及自由基、氧化物等对纯化线粒体的毒性与损伤作用的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。

技术背景

心磷脂（Cardiolipin）是线粒体膜上的主要成分之一。它对细胞氧化特别敏感。线粒体脂类分解，致使心磷脂显著减少，最终造成线粒体的严重损害。Nonyl-Acrydine Orange（NAO）是一种特异性地染色线粒体上的心磷脂，并发出荧光。一旦线粒体膜质量减少或受到损害以及被氧化，其荧光显著减弱。

产品内容

保存液（Reagent A） 毫升
染色液（Reagent B） 微升
稀释液（Reagent C） 毫升
产品说明书 1 份

保存方式

保存 染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照，其余的保存在 4℃冰箱里，有效保证 12 月

用户自备

1.5 毫升离心管：用于线粒体染色的容器比色皿：用于线粒体荧光分析的容器
荧光显微镜：用于观察荧光线粒体
荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于线粒体荧光定量分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的 染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，避免光照； 稀释液（Reagent C）放进 37℃恒温水槽里预热。然后移出 xx 微升 染色液（Reagent B）到新的 1.5 毫升离心管，加入 xx 微升 稀释液（Reagent C），混匀后，在冰槽里静置，并标记为 染色工作液，放在暗室里。同时开启荧光显微镜或荧光分光光度仪。然后进行下列操作。

一、荧光显微镜下观察

1. 从纯化的线粒体样品中移出 50 微克线粒体到新的预冷的 1.5 毫升离心管，置入冰槽里
2. 加入适量的 保存液（Reagent A）至总容量为 100 微升
3. 加入 xx 微升含有 染色液（Reagent B） 和 稀释液（Reagent C）的

染色工作液，轻柔混匀

4. 放进 37℃恒温水槽孵育 20 分钟，避免光照（注意：检测前置于冰槽里）
5. 移出 50 微升在载玻片上
6. 即刻进行载玻片压片，在荧光显微镜下进行观察（选择下列其中一种）
   1. 激发波长 580nm，散发波长 630nm

红光减弱，表明活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）

1. 2. 激发波长 495nm，散发波长 519nm

绿光减弱或降低，表明活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）

二、荧光酶标仪检测

1. 分别加入xx微升含有染色液（Reagent B） 和稀释液（Reagent C）的

染色工作液到96空板的每个孔里

2. 加入10微升纯化的线粒体样品（注意：含有5微克线粒体蛋白为理想状态）
3. 轻轻摇匀96孔板
4. 放进 37℃培养箱里孵育 20 分钟，避免光照（注意：检测前置于冰槽里）
5. 即刻放进荧光酶标仪测读（选择下列其中一种）：
   1. 波器激发波长580nm，散发波长630nm，闪烁次数10，间隔时间0.5秒，置零
   2. 或滤波器激发波长495nm，散发波长519nm，闪烁次数10，间隔时间0.5秒，置零

活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）――相对荧光单位（RFU）降低

三、荧光分光光度仪比色皿检测

1. 从纯化的线粒体样品中移出 50 微克线粒体到新的预冷的 1.5 毫升离心管，置入冰槽里
2. 加入适量的 保存液（Reagent A）至总容量为 100 微升
3. 加入 xx 微升含有 染色液（Reagent B）和 稀释液（Reagent C）的 染色工作液到 1 毫升比色皿里（注意：若使用 2 毫升比色皿，用量相应加倍）
4. 加入上述 xx 微升纯化的线粒体样品
5. 上下倾倒比色皿，轻轻混匀
6. 放进 37℃培养箱里孵育 20 分钟，避免光照（注意：检测前置于冰槽里）
7. 即刻放进荧光分光光度仪测定（选择下列其中一种）：
   1. 波器激发波长580nm，散发波长630nm，闪烁次数10，间隔时间0.5秒，置零
   2. 或滤波器激发波长495nm，散发波长519nm，闪烁次数10，间隔时间0.5秒，置零

活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）――相对荧光单位（RFU）降低