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- 上海
- 实时定量PCR（QPCR）
- 2025年07月15日
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- 文献和实验
- 技术资料
- 服务名称：
实时定量PCR（QPCR）
- 提供商：
上海百由生物
实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线
对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多
重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点。
实验步骤：
1. 样品获取、处理和制备
1.1 悬浮细胞：将悬浮细胞1×106 个/mL培养液倒入离心管中，离心沉淀细胞。PBS冲洗2次，将细胞离心底部，向离心管中
加入500-1000μl Trizol，然后置于-80度冰箱保存。或者将离心底部的干细胞置于-80度冰箱保存。
1.2 贴壁细胞：用胰酶消化细胞1×106个/mL，离心PBS冲洗2次，将细胞离心底部，向离心管中加入500-1000μl Trizol，然
后置于-80度冰箱保存。或者将离心底部的干细胞置于-80度冰箱保存。
1.3 组织：采集新鲜组织100mg，放入离心管中，做好标记，于液氮冷冻片刻后，置于-80度冰箱保存。
1.4 血液：用抗凝管收集的全血1mL，加入RNA保护剂，做好标记，置于-80度冰箱保存。
2. RNA或DNA质控
3. 反转录
4. 引物验证
5. qPCR过程
6. 数据分析
我们提供：
1. 抽取的RNA和电泳图及逆转录的cDNA样本
2. 操作步骤及详细的试剂和耗材
3. 引物序列
4. 溶解曲线和扩增曲线
5. 原始数据及处理后的正式实验数据
实验器材：
结果示意图：
温馨提醒:
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文献和实验Real-time qPCR 手册——手把手教你从菜鸟到高手
由于 Real-time qPCR 的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及 RT-PCR 的实验，也基本上被 real-time qPCR 所代替。由于 real-time aPCR 输出的数据不同于常规的 PCR 电泳检测，很多没有做过 real-time qPCR 的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。 本文就从 real-time qPCR 的发展史说起，包括 real-time
PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束
A. Real-Time PCR Chemistry Real-time systems for PCR were improved by probe-based, rather than intercalator-based, PCR product detection. The principal drawback to intercalator-based detection of PCR product accumulation
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