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- TUNEL
- 2025年07月13日
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上海百由生物
- 原理：Tunel即末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TdT-mediatedX-dUTP nick end labeling)法，细胞凋亡时双链DNA会出现许多不对称的断裂点，暴露出3’-OH,末端转移酶（TDT）可催化地G(高)辛、生物素或荧光素等标记的脱氧核苷酸加到3’-OH末端，再通过免疫组化方法进行检测，可以观察凋亡细胞的形态，染色定位及组织中的分布。Tunel法可用于细胞悬液，石蜡/冰冻切片和细胞涂片等多种样本的检测
二、试剂组成：In Situ Cell Death Detection Kit(FITC标记--HRP),Cat#:11684817910。1、酶溶液—TDT酶(末端转移酶)5×50ul;2、标记溶液[FITC-11-dUTP 10×反应混合液（内含：1mM dATP, 1mM dCTP, 1mM dGTP,0.65mMdTTP, 0.35mM b-Dutp pH6.5）] 5×550ul；3、检测试剂(抗FITC-HRP既用型 3.5ml)
三、操作流程
大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞 即PC-12 细胞爬片检Tunel
1、细胞片
⑴培养细胞贴壁培养，4%多聚甲醛固定10-20min,蒸馏水洗，0.01mol/L pH7.3 PBS 洗3×3min；
⑵ 穿孔：0.1%Triton X-100/PBS 洗5-10min，20ug/L proteinase K 消化 5min ,室温，蒸馏水洗5minX2, PBS 洗3×3min；
⑶Tunel混合液的准备 50ul TDT +450ul标记缓冲液
⑷滴加50ul/片Tunel混合液 湿盒中 37℃ 1h ；(此步需避光)
⑸0.01mol/L pH7.3 PBS 洗3×3min；
⑹滴加50ul/片抗FITC-HRP 二抗 湿盒中 37℃ 30min；
⑺0.01mol/L pH7.3 PBS 洗3×3min；
⑻.0.04% DAB+0.03%H2O2显色10min，水洗
⑼苏木素衬染1min， 水洗蓝化 系列乙醇脱水
⑽吹干后常规树胶封片。
2、石蜡切片
⑴ 4 μm石蜡切片常规脱蜡至水，
⑵ PBS洗 3×3min
⑶ 3%H2O2处理， 20min， 室温
⑷蛋白酶K 20μg/ml 10-20min 37℃
⑸0.1%Triton X-100/PBS 洗5-10min
⑹ PBS洗 3×3min
⑺Tunel混合液的准备 50ul TDT +450ul标记缓冲液
⑻30μl/每片 湿盒中 37℃ 1h ；(此步需避光)
⑼PBS洗 3×3min
⑽滴加50ul/片抗FITC-HRP 二抗 湿盒中 37℃ 30min；
⑾0.01mol/L pH7.3 PBS 洗3×3min；
⑿ 0.04% DAB+0.03%H2O2显色10min，水洗
⒀苏木素衬染1min， 水洗蓝化 系列乙醇脱水
⒁吹干后常规树胶封片。
四、观察：凋亡指数（apoptosis index，AI）在普通光镜下连续观察10个高倍视野计数阳性细胞数，换祘为平均每平方毫米的凋亡细胞数，即为AI。
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文献和实验一、原理与意义：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素biotinylate标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的链霉亲和素streptavidin特异性结合，后者又与POD底物H2O2、二氨
（In situ cell death detection kit-POD法）一、 原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧
的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。由此，TUNEL成为了检测DNA片段化(细胞凋亡)的最常用方法。(以TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒(增强型，绿色荧光)为例) TUNEL检测：使用20 U/ml Dnase处理Hela细胞10分钟。 二、TUNEL实验中关键步骤 1. 充分脱蜡和水化。脱蜡前可先将切片在 60ºC烤片 20 min，再使用二甲苯脱蜡2次，每次 5-10 min;而水化一般建议用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，便于后期试剂能充分、均匀的结合反应
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