凝胶阻滞分析(EMSA)试剂盒（化学发光法），KGS133

有关EMSA的问题

----------------------- xixi76120 wrote: yfyu1963 : 我目前准备做EMSA，检测猪的转录因子NFKB，E2F，我不想用同位素检测方法，听说化学发光法效果不错，我想请教一下：1 两者在实验操作中步骤有何大的区别么？2 化学发光法用特殊的远红外检测仪么？3 上述两种转录因子能用一个试剂盒作么？4 检测猪的转录因子与鼠和人的主要困难在哪里？需要注意点什么东东呢？ 问题多了点，谢谢

电泳迁移实验(EMSA)方法

。 5. 电泳分析：EMSA的典型分析结果可以参见下面的图1。 图1. 一个典型的EMSA/Gel-Shift分析图 1，阴性对照反应（标记探针）；2，常规反应（含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针）；3，探针冷竞争反应（含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的未标记探针）；4，突变探针的冷竞争反应（含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的未标记突变探针）；5，Super-shift反应（含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+目的转录因子的特异

我做NF-kB的EMSA实验方法和结果，条带不好，请大家指点！

。 （7）吸取上清，为核蛋白提取物。 （8）马上进行EMSA实验。 探针制备： 用γ-32P-ATP及T4多核苷酸激酶对合成的转录因子结合和突变型寡核苷酸的两条互补链分别进行末端标记。20 µl反应总体积中，加寡核苷酸10 pmol，10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液2µl，γ-32P-ATP 3 pmol，T4多核苷酸激酶10 u，37 ℃反应45 min，再置于68 ℃ 10 min灭活。在离心管中加入退火反应液60 µl，互补配对的两条链的标记产物各20 µl，于95 ℃变性5min，缓慢降温