microRNA实时定量PCR

实时荧光定量PCR技术是在普通PCR反应体系中加入荧光试剂，利用荧光信号实时检测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度。成熟miRNA是由21-25个核苷酸组成的小RNA，由于长度太短，不能通过传统的实时定量PCR进行检测。本公司通过特殊设计的茎环结构的反转录引物，配合实时定量PCR引物及探针可以精确检测微量样品中miRNA表达水平，也可以用终点PCR法定性检测。

英拜为您提供miRNA 实时定量PCR技术服务，您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，本公司专业的技术服务人员就可替您完成miRNA实时定量PCR实验操作和数据分析，提供给您完整的实验报告，为您节省大量的时间和精力。

miRNA实时定量PCR技术服务流程如下：
















miRNA实时荧光PCR原理图

1. 引物设计、合成
设计并合成目的miRNA的茎环RT引物、PCR引物和检测用荧光探针，并合成该miRNA相应的DNA寡核苷酸作为标准。
2. 样品RNA抽提
a．组织样品：取适量（50～100mg）新鲜组织或正确保存的组织样品，匀浆后用PURELINK^TM试剂抽提RNA。
b．细胞样品：取1×10⁶～1×10⁷细胞，PBS清洗细胞，吸去PBS后用PURELINK^TM试剂抽提RNA。
3. RNA质量检测
a． 紫外吸收测定法测定RNA在波长260nm和280nm的吸收值，获得RNA的浓度并通过A260/280及A260/230的吸收比值判断RNA的纯度。
b． 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。
注：用于miRNA实时定量PCR检测的RNA样品，必须高纯度、完整，没有RNase 污染（降解的样品不能用于实时定量PCR检测），同时提取方法必须保证所得样品包含完整的小RNA部分。
4. 逆转录合成cDNA
利用茎环引物逆转录合成cDNA第一链。
5. 实时定量PCR
以合成的cDNA作为模板进行实时定量PCR扩增，梯度稀释的标准同时进行实时定量PCR扩增，根据Ct值制备标准曲线。以同样的方法测定每个样品中U6 snRNA含量作为内参.
6. 分析结果、提供实验报告
分析实时定量PCR结果，根据标准曲线定量样品中的目的miRNA。提供实验报告，包括详细的实验方法，实时定量PCR实验数据和图表。