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T7核酸内切酶 I

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    ■ 识别错配 DNA
    ■ 分解四方向交叉 DNA 或分支 DNA
    ■ 检测或切割异源二聚体 DNA 和切刻 DNA
    ■ 随机切割线性 DNA 进行 shot-gun 克隆


    概述
    T7 核酸内切酶 I 识别并切割不完全配对 DNA、十字型结构 DNA、Holliday 结构或交叉 DNA、异源双链 DNA 或者以更慢的速度切割含切刻的双链 DNA。该酶是 T7 基因 3 的编码产物。


    来源
    截短型无活性的 T7 核酸内切酶 I（tT7 Endo I）与麦芽糖结合蛋白（MBP）融合表达，利用 IMPACTTWIN 系统对融合蛋白进行纯化，得到 C-端带有硫酯键的 tT7 Endo I。将合成的多肽序列（从 tT7 EndoI 截下来的序列）与上述携带硫脂键的 tT7 Endo I 在体外进行连接反应（1），得到全长且有活性的 T7 核酸内切酶 I。


    反应条件
    1X NEBuffer 2 [50 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2 ，1 mM DTT（pH 7.9 @ 25 ℃）]，37 ℃ 温育。


    质保声明
    无核酸内切酶和外切酶污染。


    单位定义
    1 单位指在 50 μl 反应体系，37°C 条件下1 小时，将 90% 以上的 1 μg 超螺旋十字型结构 pUC(AT)* 转化成90%以上的线性结构所需要的酶量。
    * pUC（AT）来自 pUC19，在其 EcoR1 和 Pst1 位点之间的多克隆位点处有修改。


    浓度
    10,000 units/ml。


    贮存条件
    200 mM NaCl，20 mM Tris-HCl (pH 7.5)，0.1 mM EDTA,，1 mM DTT， 0.15% Triton X-100 和 50% 甘油。于 -20°C 贮存。


    热失活
    无。


    使用注意
    T7 核酸内切酶 I 是一种具有底物结构选择性的酶。该酶以不同的活性作用于不同的 DNA 底物。切割特定底物时，必须控制酶量和反应时间。
    反应温度超过 42 ℃ 时，会增加非特异性核酸酶活性。


    参考文献
    (1) Xu, M.-Q and Evans, T.C. (2001) Methods , 24, 257–277.
    (2) Parkinson, M.J. and Lilley, D.M.J. (1997) J. Mol. Biol .,270, 169–178.
    (3) White, M.F. et al. (1997) J. Mol. Biol ., 269, 647–664.
    (4) Hadden, J.M. et al. (2001) Nat. Struct. Biol ., 8, 62–67.


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