DNA 聚合酶 I, (Klenow) 大片段

♦  用随机引物制备探针

♦  补平 5' 突出端，形成平末端（1）

♦  切除 3' 突出端，形成平末端（1）

♦  合成 cDNA 第二条链

♦  诱变反应中第二条链的合成（2）

♦  双脱氧法 DNA 序列测定（Sanger 法）（3）

DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)是E. coli DNA聚合酶I的蛋白水解产物，具有DNA聚合酶活性和3´→5核酸´外切酶活性，但缺失了5´→3´核酸外切酶活性。Klenow既保留了聚合酶的高保真性，又不会降解5´末端DNA。

来源：来源于重组融合的E. coli polA 基因，应用基因重组技术，将麦芽糖结合蛋白(MBP)基因取代了E. coli polA 的5´→3´核酸酶外切结构域，表达的融合蛋白经切割并分离纯化去除MBP，获得Klenow片段，其氨基和羧基末端与常规方法制备的klenow片段相同。

1X NEBuffer 2 [50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂ , 1 mM DTT (pH 7.9 @ 25°C)]。加入dNTPs (不随酶提供)。

当添加dNTPs后，Klenow片段在四种NEBuffer和T4 DNA连接酶反应缓冲液中都有活性。

1 单位指 37 ℃ 条件下，30 分钟内使 10 nmol 的 dNTP 掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。

1单位指在37°C条件下，30分钟内能使10 nmol 的dNTPs掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。

1X NEBuffer 2中加入33 μM dNTPs，包括[³ H]-dTTP和70 μg/ml的变性鲑鱼精DNA。

5,000和 50,000 units/ml。

25 mM Tris-HCl (pH 7.4),0.1 mM EDTA, 1 mM DTT和50%甘油，贮存于-20°C。

75°C 20分钟。

由于该酶具有3´→5´核酸外切酶活性，升高反应温度、加入过量的酶、未加入dNTP或反应时间过长均会导致DNA末端碱基被切除形成凹陷。

(1) Sambrook, J. et al. (1989). Molecular Cloni ng: A Laboratory Man ual, (2nd ed.), (pp. 5.40–5.43). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
(2) Gubler, U. (1987). In S.L. Berger and A.R. Kimmel (Eds.), Methods in Enzymology Vol.152, (pp. 330– 335). San Diego:Academic Press.
(3) Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 74, 5463–5467.