免疫组织染色

技术简介

1)技术原理:

免疫组化（immunohistochemistry）是利用抗原和抗体特异性结合原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（酶、荧光素和金属离子等）显色或发光来检测组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定性及定量的原位检测。

免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自显影法等。

这些常用免疫组织化学方法的原理如下：

1. 免疫荧光细胞化学技术

将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光,从而可以确定组织中的抗原定位或定量.

2. 免疫酶细胞化学技术

是目前免疫组织化学研究中最常用的技术．基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究．

3. 免疫胶体金技术

就是用胶体金标记一抗，二抗或其他的能特异性的结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针对组织或细胞内的抗原进行定性，定位或定量研究．由于胶体金的电子密度高，多用于免疫电镜的单标记或多标记的定位研究．

2）特点及意义：

随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难肿瘤得到了明确诊断。在常规肿瘤病理诊断中，5%-10%的病例单靠H.E.染色难以作出明确的形态学诊断。尤其是免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时，准确率可达50%-75%

特异性强

免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。

敏感性高

在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP三步法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。

定位准确、形态与功能相结合

该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学领域开展深入研究是十分有意义的。

3）操作步奏

⑴、石蜡切片脱蜡至水。

⑵、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

⑶、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。

⑷、 5-10% 正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。

⑸、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。

⑹、滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。

⑺、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。

⑻、滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。

⑼、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。

⑽、显色剂显色 3-15 分钟（DAB 或 NBT/BCIP）

⑾、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。