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- 高分辨率熔解曲线（HRM）技术服务
- 上海
- 2025年07月14日
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- 服务名称：
高分辨率熔解曲线（HRM）技术服务
- 提供商：
生工生物工程
技术背景
高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称 HRM ，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新方法。基本原理是基于核酸分子由于片段长短、 GC 含量、GC 分布及单个碱基差异等物理性质不同而造成DNA 分子在加热变性时都会有不同的熔解曲线的形状和位置，并配合运用高浓度的饱和荧光染料，可以迅速的检测出核酸片段中GC含量和单碱基的突变。
技术优势
- 高通量：1次可同时检测10-384样本。
- 高敏度：HRM检测灵敏度达1%-0.1%，是传统“PCR+测序”方法25-250倍。
- 特异性好：PCR产物无需后续处理，特异性达100%。
- 重复性好：用HRM方法进行分析时，样品经PCR扩增后直接进行HRM，PCR产物无需再转入其它分析装置，而直接在同一个PCR管内进行分析，实现闭管操作，避免交叉污染。
- 操作简便：只需设计PCR引物，进行PCR反应，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限，在Roche LlightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器上直接获得高分辨率熔解曲线分析，即可完成对样品基因型的判断。
- 成本低：相比传统的SNP/突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且拓展了其应用面。
由于上述优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。其中，主要的研究方向集中在：
- 基因未知突变以及 SNP 的扫描；
- 已知突变及 SNP 的基因分型；
- 动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定；
- 法医鉴定、亲子鉴定；
- HLA 的配型；
- 甲基化的研究等。
技术平台
近年来，公司引进了Roche LightCycler® 480 II 和ABI VIIA7 全自动荧光定量PCR系统，由从事多年HRM研究专家配套专业的HRM 分析软件，开辟了自己独特的研究策略和方法， 为客户打造专业化HRM服 务。
服务内容
1 外显子突变位点筛查
1.1 实验过程：外显子引物设计（300bp以内）→上机预实验（确定引物特异性，无非特异性扩增）→正式实验→HRM分析→差异样品外显子测序。
1.2 提供结果：完整实验报告（包括实验过程、试剂耗材、荧光PCR仪原始文件、测序文件等）。
1.3 实验实例：对182个病例的PIK3CA 基因第20外显子进行筛查，筛出2个有突变病例。
2 已知SNP位点检测
2.1 实验过程：SNP引物设计（200bp以内）→PCR预实验（确定引物特异性，无非特异性扩增）→正式上机实验→HRM分析→不同基因型测序验证。
2.2 提供结果：完整实验报告（包括实验过程、试剂耗材、荧光PCR仪原始文件、测序文件等）。
2.3 实验实例：对53个病例的rs7193343位点进行HRM检测，分析出不同的3种基因型。
3 Cold-PCR & HRM检测低水平基因突变体
3.1 技术简介：
许多癌症的发生与体细胞中低水平的DNA突变的发生相关，如低水平FMR1基因型与乳腺癌和卵巢癌相关联；低水平的BRAFV600E突变基因与直肠癌发 生关联。这些基因如果在胚胎发育过程中发生完全突变可能是致命性的，只有只有那些携带低水平基因突变型的胚胎才能够存活下来。所以癌症体细胞中基因分子层 面的突变，常常需要在大量野生型DNA中辨识低浓度的DNA突变。但是，突变检测方法的选择率和灵敏度常常限制了鉴定低浓度突变的可靠性。COLD- PCR解决了低含量基因突变检测的一些局限性，在PCR扩增过程中利用关键变性温度来提高含有突变的扩增子丰度，以便于在PCR后的可以直接测序检测到基 因低水平的突变。然而碱基测序仍然是昂贵的选择，从而通过高通量扫描序列预检是有吸引力的办法。高分辨率融解（HRM）是一种可用于预筛查测序之前未知突 变的技术，但不能确定具体的检测基因突变的身份。因此，为了富集、快速筛查和鉴定低浓度的未知突变，我们把HRM突变扫描和COLD-PCR相结合，随后 进行已知突变的直接测序鉴定，大大提高了检测效率。
3.2 实验过程：引物设计（300bp以内）→PCR预实验（确定引物特异性，无非特异性扩增）→正式上机Cold-PCR实验→HRM分析→突变型测序验证。
3.3 提供结果：完整实验报告（包括实验过程、试剂耗材、荧光PCR仪原始文件、测序文件等）。
3.4 实验图例：
4.1 实验过程：待测基因序列片段或位点甲基化引物设计（200bp以内）→ 利用甲基化转移酶修饰的DNA和非甲基化修饰的DNA制备标准品（100％和0％CpG甲基化）→ 上机预实验（一般制作0％，1％，5％，10％，20％，50％，100％梯度 HRM标准曲线）→ 正式实验（亚硫酸氢盐处理样品DNA→PCR→HRM分析→克隆测序验证）→ 实验报告。
4.2 提供结果：完整实验报告（包括实验过程、试剂耗材、荧光PCR仪原始文件、测序文件等）。
4.3 实验实例：对2个病例的某基因20个CG位点进行检测，分析出不同的甲基化程度。
服务说明
① 样品要求：
﹡ 血液样品：样品为EDTA抗凝或枸椽酸钠抗凝，样品量大于0.5 ml，样品采集后于-20℃或-80℃保存，低温（≤-4℃）运输。
﹡ 组织样品：样品可以为新鲜组织（最好-80℃保存）或石蜡包埋的组织，也可以是95%乙醇中固定的组织，组织量大于100 mg。
﹡ DNA样品：纯度OD260/280 比值为 1.8-1.9，浓度≥20ng/ul，体积≥20ul。
服务价格与周期
| 服务内容 | 单价 | 实验期限 | 备注 |
| 外显子突变位点筛查 | 30 元 / 反应 | 5 ～ 10 个工作日 |
＞ 100个询价
测序验证费另外收费
|
| 已知 SNP 位点检测 | 25 元 / 反应 | 5 ～ 10 个工作日 | |
| Cold-PCR & HRM 检测低水平基因突 变体 | 50 元 / 反应 | 10 ～ 15 个工作日 | |
| 甲基化状态检测 | 280 元 / 样本 / 基因 | 10 ～ 15 个工作日 | ＞ 50个询价 |
联系人：张老师（项目部） 电话：021-37772163 Email：
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参考文献：
1. Helen E. White, Victoria J. Hall, and Nicholas C.P. Cross. Methylation-Sensitive High-Resolution Melting-Curve Analysis of the SNRPN Gene as a Diagnostic Screen for Prader-Willi and Angelman Syndromes. Clin. Chem., Nov 2007; 53: 1960 - 1962.
2. Emilia Wiechec, Carsten Wiuf, Jens Overgaard, and Lise Lotte Hansen. High-Resolution Melting Analysis for Mutation Screening of RGSL1, RGS16, and RGS8 in Breast Cancer. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., Feb 2011; 20: 397 - 407.
3. E S K Ma, C L P Wong, F B F Law, W-K Chan, and D Siu. Detection of KRAS mutations in colorectal cancer by high-resolution melting analysis. J. Clin. Pathol., Oct 2009; 62: 886 - 891.
4. Alessandro Martino, Tommaso Mancuso, and Anna Maria Rossi. Application of High-Resolution Melting to Large-Scale, High-Throughput SNP Genotyping: A Comparison with the TaqMan® Method. J Biomol Screen, Jul 2010; 15: 623 - 629.
5. Lasse S. Kristensen and Alexander Dobrovic. Direct Genotyping of Single Nucleotide Polymorphisms in Methyl Metabolism Genes Using Probe-Free High-Resolution Melting Analysis. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., May 2008; 17: 1240 - 1247.
6. Vartul Sangal, Kathryn E.Holt, Jianfeng Yuan, Derek J. Brown, Ingrid Filliol-Toutain, François-Xavier Weill, Dong-Wook Kim, Wanderley Dias da Silveira, Derek Pickard, Nicholas R. Thomson, Julian Parkhill, and Jun Yu. Global Phylogeny of Shigella sonnei Strains from Limited Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) and Development of a Rapid and Cost-Effective SNP-Typing Scheme for Strain Identification by High-Resolution Melting Analysis. J. Clin. Microbiol., Jan 2013; 51: 303 - 305.
7. Emilia Wiechec, Carsten Wiuf, Jens Overgaard, and Lise Lotte Hansen. High-Resolution Melting Analysis for Mutation Screening of RGSL1, RGS16, and RGS8 in Breast Cancer. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., Feb 2011; 20: 397 - 407.
8. B Boisselier, Y Marie, M Labussiere, P Ciccarino, V Desestret, X Wang, L Capelle, JY Delattre, and M Sanson.COLD PCR HRM: a highly sensitive detection method for IDH1 mutations. Hum Mutat, Dec 2010; 31(12): 1360-5.
9. Coren A. Milbury, Jin Li, and G. Mike Makrigiorgos. COLD-PCR–Enhanced High-Resolution Melting Enables Rapid and Selective Identification of Low-Level Unknown Mutations. Clin. Chem., Dec 2009; 55: 2130 - 2143.
10. E Stadelmeyer, E Heitzer, P Wolf, and N Dandachi. COLD-HRM PCR versus conventional HRM PCR to detect the BRAF V600E mutation A real improvement?. J Mol Diagn, Mar 2011; 13(2): 243.
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文献和实验相关实验
光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段DNA都有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合子（下图）。 检测SNP的方法有很多种。成本较低、通量较大的方法大都局限于已知、特定位点，如Taqman探针法。既要对已知位点分析又要查找未知位点，一般采用PCR+测序的方法，成本高、操作繁复较低。 作为新一代的遗传扫描工具，HRM技术是一种低成本、高通量、快速，且不受位点局限的检测
位点多，样本少）的高通量方法。同时，也是基因芯片筛选后的多个基因在更多标本中验证的最佳方法。 突变-HRM 检测技术原理： 在一定的温度范围内将PCR 扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段DNA 都有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同DNA 指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型和突变型基因。 不同的基因型表现为不同的HRM 熔解曲线形状
互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。同许多荧光PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合
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