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DNA文库构建及EST测序
DNA文库构建及EST测序
生工生物工程
生工基于Clontech的SMART方法和独具的技术优势及严格的质量控制,确保客户得到满意的 cDNA文库,可以使您获得最多的全长基因,全长率最高可达90%;结合完整的实验室构架,无缝对接3730XL测序平台可同时进行EST测序,使您更有 效地节省时间,提高效率。
十年多来,生工先后对线虫、真菌、白色念珠菌、盐藻、华支睾吸虫、油菜、水稻、棉花、大鼠、小鼠、人等数十个物种进行cDNA文库构建和Unigene测序,先后测定了数百万个序列,拥有丰富的均质化文库构建经验。
实验流程见右图:
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ESTs即表达序列标签(expressedsequence tags, ESTs),短的、单次(测序)阅读的cDNA序列,也包括来自于差异显示和RACE实验的cDNA序列。对构建好的文库进行测序,同时可以获得ESTs信息分析服务。
W4-2-1 EST测序的应用
1.基因的表达谱分析;
2.从EST中可以发掘SSR标记;
3. EST可以作为构建分子标记连锁图谱所用的探针。
W4-2-1EST服务内容ESTs信息分析服务又分为基本信息分析服务和高级信息分析服务。
具体分析流程见右图。
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4-3 服务报价及服务须知
项 目 | 内 容 | 价 格 |
Smart cDNA文库 | cDNA文库构建 | 15,000.00元(赠20个测序) |
均一化cDNA文库 | 全长cDNA文库构建 | 25,000.00元(赠50个测序) |
EST测序 | <5,000条 | 25.00元 |
5,000-10,000条 | 22.00元 | |
>10,000条 | 询价 | |
基础信息服务 | 免费 | |
高级信息服务 | 询价 | |
送样要求 | 提供保质保量的组织(5 g)、细胞株(2×107细胞)、总RNA>20 μg | |
实验周期 | 4~6周 |
实验内容
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提供的结果及材料 |
第一阶段
1. 提取总RNA,分离、纯化总mRNA后,进行反转录合成cDNA第一链。
2. 通过引物延伸或LD-PCR法进行dscDNA合成,经SfiI酶切后,经层析柱分离cDNA(回收大于500 bp的cDNA)。
3. 将分级纯化的dscDNA与SfiI酶切的逆转录病毒载体(Amp抗性)连接。
4. 将重组产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞。
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1. 高质量的起始RNA变性电泳图。
2. dscDNA电泳图和 的SfiI酶切图。
3. 转化大肠杆菌生长的重组克隆(即原始库)培养皿照片。
4. 详细的研究结果和分析。
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第二阶段
1. 甘油保存大肠杆菌文库。
2. 初级cDNA文库的QC。
(1)不同稀释度测定平均滴度,检测库容量(重组子克隆数目)。
(2)随机挑取40个克隆子,PCR方法或SfiI酶切检测重组克隆子比例(重组率),检测平均插入片段大小。
(3)每个文库随机挑取20个克隆子抽提质粒进行双向测序,通过序列分析判断插入片段是否含有全长ORF。
3. 文库验收标准:
库容量: >1×107 cfu/ml 平均插入片段: >1.2 kb 重组率:>95% 全长基因比例:>65%
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1. 不同稀释度生长的重组克隆培养皿照片和平均滴度计算过程 。
2. 构建好的初始cDNA文库的菌液(含甘油)5 ml,分装0.5 ml/管(冻存-80°C)。
3. 40个克隆子的PCR鉴定电泳图(含marker标注)和插入片段长度数据。
4. 20个随机克隆子的双向测序报告纸制版(含测序引物序列和所在载体位置)和分析 。
5. 文库的评价,包括库容量、插入片段平均长度、重组效率、cDNA 完整性评价。
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