谱度众合磷酸化修饰定量蛋白质组检测分析

蛋白质磷酸化是由激酶和磷酸酶协同调控的可逆性翻译后修饰，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡及代谢等几乎全部生命活动的精细调控。然而，磷酸化修饰具有动态范围宽、丰度低、位点异质性高等特点，传统生化手段难以实现其系统性、全局性解析。

为突破这一瓶颈，本项目整合高灵敏度定量蛋白质组学技术与特异性修饰肽段富集策略，实现对不同实验组间蛋白质磷酸化修饰水平的相对定量比较，系统筛选差异修饰位点，并结合深度生物信息学分析，为揭示信号转导通路及功能调控机制提供关键数据支撑与线索导向。

在复杂蛋白酶解产物中，磷酸化肽段丰度极低，且其离子化效率易受高丰度非磷酸化肽段的抑制，因此，高效富集是磷酸化蛋白质组学分析的关键前提。在酸性条件下，二氧化钛（TiO2）材料表面带正电荷，能够选择性吸附带负电荷的磷酸化肽段，富集效率可达95%以上。

在此基础上，谱度众合基于自主研发的磷酸化肽段富集装置及富集方法（国家发明专利号：ZL 2019 1 1265126.0），进一步优化了富集流程的稳定性与重现性。该专利技术通过改进富集柱结构与洗脱工艺，有效降低了非特异性吸附，提升了低丰度磷酸化肽段的回收效率，尤其适用于微量样本的深度解析。

样本经过蛋白提取、酶切等步骤得到肽段混合物后，使用特异的富集技术对修饰肽段进行富集，通过高分辨、高灵敏的质谱扫描得到质谱谱图数据，再经过数据库检索、生物信息学分析等阶段最终获得完整分析结果。

适用于信号通路激活或抑制的动态追踪，可比较不同刺激条件（如生长因子、激素、药物、应激等）下磷酸化修饰位点的瞬时或持久变化，锁定关键信号节点（如MAPK、PI3K-AKT、JAK-STAT、NF-κB等通路）。

在肿瘤发生发展研究中，可用于筛选癌基因或抑癌基因相关的异常磷酸化事件，例如EGFR、KRAS、p53等突变驱动的磷酸化重编程，从而揭示耐药或转移的新机制。

通过比较用药前后细胞或组织中的磷酸化修饰谱，判断药物是否有效作用于预期靶点及其下游信号通路，为药效评估与靶点验证提供直接证据。

适用于疾病早期诊断或分型研究，可检测临床样本中磷酸化位点的丰度差异，作为潜在蛋白标志物；亦可用于预后评估与治疗响应预测，筛选与药物敏感性或患者生存相关的修饰标志物。

可用于植物逆境胁迫响应（如干旱、盐碱、病虫害）中磷酸化修饰调控的防御信号网络解析；也可应用于病原微生物与宿主互作研究，探讨病原体效应蛋白如何劫持宿主磷酸化系统，或宿主抗感染信号的激活机制。

通过比较目标激酶抑制/激活前后细胞中的蛋白修饰位点的变化，揭示受激酶作用的底物及调控机制。

首先对每个样本中检测到的磷酸化修饰位点及其对应蛋白数目进行统计（图A）。随后，通过联合分析与定量热图，展示不同组别间共有及特有的修饰位点，并呈现其丰度分布趋势（图B、C）。对每个样本中修饰位点的定量值进行分布分析，结果表明其近似服从正态分布，且不同样本间分布特征基本一致（图D）。相关性分析进一步验证了样本间良好的定量重复性（图E）。

Figure 1. Overview of Modification.

(A) 修饰位点及其蛋白数目条形图。(B) 样本组间修饰位点韦恩图。(C) 修饰位点定量热图。(D) 修饰位点定量分布山脊图。(E) 修饰位点定量相关性图。

基于差异倍数与P值阈值，系统筛选各比较组间的差异修饰位点（图A）。联合分析结果进一步展示了不同比较组间差异位点的重叠情况（图B）。火山图直观呈现了差异修饰位点的上调和下调全局分布（图C）。同时，差异位点的定量热图清晰揭示了其在各样本中的表达模式（图D）。

Figure 2. Differential Modification Analysis.

(A) 差异位点数目统计。(B) 差异位点韦恩图。(C) 差异位点火山图。(D) 差异位点热图可视化。

整合GO（图A、B）与KEGG（图C、D）通路富集分析，并结合亚细胞定位（图E）及转录因子（图F）预测，系统揭示差异修饰蛋白参与的生物学过程与关键信号通路。

Figure 3. Functional Enrichment Analysis.

(A) DESPs的GO注释条形图。(B) GO富集分析气泡图。(C) DESPs的KEGG注释条形图。(D) KEGG富集分析气泡图。(E) DESPs的亚细胞定位注释条形图。(F) 转录因子家族注释条形图。

基于STRING数据库获取差异修饰位点对应蛋白（DESPs）间的相互作用信息，构建全局蛋白互作网络（图A）。在此基础上，分别依据差异倍数（FC）和节点连接度（Degree）筛选变化最显著或连接最为密集的核心蛋白，进一步构建两个核心互作网络（图B、C），以聚焦关键调控节点。

Figure 4. Protein-protein interaction (PPI) network analysis.

(A) 差异蛋白互作网络图。(B) 差异核心蛋白互作网络图。(C) 核心枢纽蛋白互作网络图。

通过保守基序（motif）分析，识别修饰位点上下游的序列特征模式。针对全部检测到的修饰位点，提取主要基序类型，并以motif logo形式展示其中6种代表性基序（图A）。对各比较组筛选所得的差异修饰位点（DESs）进行motif统计，选取匹配位点数排名前20的基序进行展示（图B、C）。在此基础上，进一步分析上述显著富集基序所对应差异位点的差异倍数（FC）变化趋势（图D），以评估不同基序背景对修饰水平调控幅度的潜在影响。

Figure 5. Conserved Motif Analysis.

(A) motif logo图。(B) motif对应位点数目分布条形图。(C) motif富集分析气泡图。(D) motif对应差异位点变化情况箱型图。

激酶（Kinase）是一类催化磷酸基团从高能供体分子（如ATP）向特定底物蛋白转移的酶，是磷酸化修饰的核心执行者。本部分以磷酸化位点的定量数据为基础，系统评估激酶自身的磷酸化变化及其对下游底物的调控。首先，以火山图展示不同比较组间激酶蛋白上磷酸化位点的差异分布（图A）；以热图展示上述激酶中差异位点的定量表达模式（图B）。随后，将差异位点所对应的上游激酶映射至激酶树，展示其在激酶家族中的分布（图C）；通过激酶-底物关系网络，呈现差异位点及其上游激酶之间的调控关系（图D）；并针对各比较组分别绘制其差异位点对应的上游激酶互作网络（图E）。为进一步挖掘磷酸化数据的调控信息，采用激酶-底物富集分析（Kinase-Substrate Enrichment Analysis, KSEA），预测上游激酶活性的变化趋势（图F）。

Figure 6. Kinase-Substrate Enrichment Analysis.

(A) 激酶中磷酸化位点火山图。(B) 激酶差异位点热图。(C) 上游激酶树状图。(D) 激酶-底物关系网络图。(E) 各比较组差异位点的激酶-底物关系网络图。(F) 激酶活性条形图。

为保证统计学效力，建议细胞实验每组至少设置3个生物学重复，动物实验每组至少设置5个生物学重复。

（1）样品应为预冷PBS清洗后的细胞沉淀，置于EP管中冻存和寄送。

（2）细胞数不少于1×107；或细胞沉淀体积不少于50μL；或不少于15cm培养皿（细胞培养密度>80%）的细胞量。

（3）-20℃以下低温冻存，干冰寄送。

（1）样品应来源于单一部位组织，剪碎后以预冷生理盐水或PBS清洗至清洗液中不见血色，用干净滤纸吸干残留液体后，置于EP管中冻存和寄送。

（2）组织重量不少于50mg。

（3）-20℃以下低温冻存，干冰寄送。

标题：PTPN23[Thr] variant reduces susceptibility and tumorigenesis in esophageal squamous cell carcinoma through dephosphorylation of EGFR[1]

期刊：Cancer Letters（IF=11.8）

分区：JCR 1区/中科院 1区

客户单位：华中科技大学同济医学院公共卫生学院

添加图片注释，不超过 140 字（可选）

标题：Evaluation of DDA Library-Free Strategies for Phosphoproteomics and Ubiquitinomics Data-Independent Acquisition Data[2]

期刊：Journal of Proteome Research（IF=3.8）

分区：JCR 2区/中科院 2区

客户单位：厦门大学

添加图片注释，不超过 140 字（可选）

六、总结：为何选择我们的磷酸化蛋白质组学服务？

您只需提供细胞、组织等样本，即可获得远超常规修饰组定量的深度分析报告。从修饰概览、差异筛选、功能富集（GO/KEGG）、蛋白互作网络（PPI），到保守基序（Motif）和激酶-底物分析（KSEA），报告构建了一个完整的“磷酸化事件→生物学通路→上游激酶”的调控网络图景。特别是激酶活性预测，能直接为您指向关键的调控节点，为药物靶点发现提供明确线索。

从样本到报告，从报告到论文——每一步都有我们的技术团队全程护航。助力您的研究方向更明确、验证效率更出色、论文发表更顺利。

关于谱度众合

谱度众合是一家由武汉大学生科院博士团队创办的“国家高新技术企业”，持续深耕基于质谱技术的蛋白质研究领域20年，区别于一般组学公司仅提供检测数据和常规分析，谱度众合针对特定研究目的开发最佳解决方案（例如：互作蛋白筛选、药物靶点研究、分子机制解析、生物标志物发现等），帮助医学和农学科研工作者提高实验成功率2倍以上，极大加速研究进程。