真核蛋白表达纯化+MST分子互作：揭秘重金属如何通过NLR"

真核蛋白表达纯化+MST分子互作：揭秘重金属如何通过NLR"唤醒"植物免疫

摘要

该研究利用真核表达系统（HEK293T和Sf9细胞）表达纯化STM1/STM2全长重组蛋白，深入解析其分子机制。运用MST等多种互作检测技术一致证明STM1与STM2既可发生同源多聚化，也可形成异源复合物，且STM1抑制STM2的多聚化，从而阻断其免疫激活。首次鉴定出直接结合过渡金属的NLR受体，为植物重金属胁迫与病原菌防御提供了全新分子机制。

2026年5月，南京农业大学赵方杰团队与中国科学院分子植物科学卓越创新中心万里团队在Nature Plants发表了“Transition metal-enhanced immunity in Arabidopsis roots via an NLR pair”的研究论文，该研究发现了一对在根系中表达的NLR抗病基因发挥权衡植物对过渡金属耐性与对土传青枯病菌抗性的功能，揭示了过渡金属通过提升NLR胞内受体蛋白的活性增强根系免疫力的机制。

植物同时面临生物胁迫（病原菌）和非生物胁迫（如重金属污染），CAD1编码植络合肽合酶，cad1-3 是一个已知功能丧失的突变等位基因，对Cd（镉）敏感，同时已知stm对过渡金属敏感，所以研究者在此基础上构建出Cd超敏感突变体stm1-1 cad1-3，通过MutMap分析确定致病基因At5g45210，命名为STM1。STM1旁边有一个头对头排列的TNL基因At5g45200，命名为STM2，stm2敲除完全恢复stm1的Cd敏感表型到WT水平，二者功能拮抗，共同调控对二价过渡金属的耐受性。

随后研究者构建了STM1-GFP和STM2-GFP拟南芥稳定表达植株，进行亚细胞定位发现能观察到STM1-GFP正常表达，而STM2-GFP极不稳定，检测不到荧光，于是将STM1与STM2在烟草叶片中瞬时表达，通过亚细胞定位确定STM1核质双定位、STM2仅细胞质定位。

图1：STM1，STM2在烟草叶片中的亚细胞定位

为研究STM2激活免疫的分子机制，研究者分别在昆虫表达系统sf9细胞和哺乳表达系统HEK293细胞中表达纯化了STM1和STM2重组蛋白，进行体外NADase酶活实验，发现STM2具有典型的TNL酶活功能，而STM1没有，且STM1抑制STM2活性，过渡金属增强STM2活性。

TIR结构域是TNL酶活功能的核心催化区域，通过序列比对TIR结构域序列发现STM2-TIR存在一个保守催化残基E91，而STM1没有。于是，在原核系统大肠杆菌中分别表达STM1-TIR和STM2-TIR，及STM2-TIR突变型（E91G、E91K、E91A）再次NAD酶活检测，结果发现E91突变后STM2-TIR失去酶活功能，验证了STM2-TIR的关键功能位点。

研究者推测，二价过渡金属可能直接结合 STM2 以增强其活性。因此，通过微量热泳动（MST）技术测试了 STM1 和 STM2 是否能结合 Cd²⁺、Zn²⁺ 和 Cu²⁺。使用昆虫系统表达的重组STM1蛋白和哺乳系统表达的重组STM2蛋白进行MST检测表明，STM2能以微摩尔级别的解离常数结合Cd²⁺、Zn²⁺ 和 Cu²⁺，而STM1不能结合，验证了以上结果。

图2 MST测定重组STM2和STM1蛋白结合Cd²⁺、Zn²⁺和 Cu²⁺

为探究STM2的金属结合关键氨基酸位点，用原核表达系统分别表达纯化了STM2的TIR和TRR结构域，MST检测发现TIR结构域对三种金属的结合亲和力比TRR结构域低得多。于是通过金属离子与STM2-TRR分子对接预测到四个关键结合位点（C595、C599、C1109 和 H1022 ），将这四个位点进行丙氨酸突变，并将各突变型STM2-TRR进行MST检测，检测结果表明当STM2-TRR四个位点均突变为丙氨酸时，金属结合亲和力大幅降低。表明， LRR 结构域中的 C595、C599、C1109 和 H1022 是二价过渡金属配位结合的关键位点。

图3 MST测试重组野生型STM2和STM2-4突变体结合Cd²⁺、Zn²⁺和 Cu²⁺

NLR蛋白的寡聚化是其免疫功能的必要条件，研究者通过双分子荧光互补（BiFC）测定发现STM1能够与自身以及STM2发生物理相互作用。在烟草叶中进行的STM1和STM2的瞬时共免疫沉淀（CoIP）实验同样显示二者相互作用，通过在昆虫细胞中共表达以及Pull down实验，进一步验证了STM1与STM2之间的相互作用。

图4 STM1、STM2双分子荧光互补（BiFC）（a）；CoIP（b）；Pull down（c）结果

为检测STM1是否影响STM2的多聚化。将Flag–STM2或Flag–STM2 + strep–STM1通过凝胶过滤分离。STM2单独表达时对应最小分子量约440 kDa（单体约148 kDa），表明STM2可能处于不稳定的多聚化状态。加入Strep–STM1后，Flag–STM2对应最小分子量约158 kDa，表明STM1通过形成STM1–STM2复合物阻碍了STM2的多聚化。

图5 凝胶过滤层析，通过SDS-PAGE检测采集洗脱物

最后，研究者结合更多实验结果表明，过渡金属增强了STM2激活的免疫力，而STM1抑制了STM2激活的免疫力，并且过渡金属的敏感性与对青枯菌R. solanacearum的敏感性之间存在权衡。该研究揭示了一种新的NLR功能模型，揭示阿拉伯芥NLR免疫受体STM1/STM2通过感知过渡金属离子调控植物免疫与抗病性的拮抗机制。

佰莱博生物提供昆虫表达纯化系统、哺乳动物细胞表达纯化系统、原核表达纯化系统。采用高压破碎仪破碎细胞以保持蛋白活性，采用AKTA蛋白纯化系统纯化蛋白以保证蛋白的纯度。并提供MST、SPR、BiFC、CoIp等生物分子互作实验及酶活性检测等实验。