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分子对接只是基于计算机算法的理论预测，不能证明化合物与靶蛋白在现实中发生物理结合。要证明“化合物—靶点”或“蛋白—蛋白”互作，需要建立完整证据链：计算预测 → 体外生物物理验证 → 细胞原位验证 → 结合位点确认 → 功能闭环。本文汇总20+种验证方法，覆盖SPR、BLI、MST、ITC、FP、CETSA、FRET、PLA、Pull-down-MS、DARTS-MS、TPP、LiP-MS、ABPP、Co-IP、X-ray、Cryo-EM、NMR、定点突变等，并给出选择建议。

SPR（表面等离子体共振）作为研究生物分子相互作用的黄金标准，能够精确量化分子间的亲和力与动力学。本指南旨在系统性地介绍SPR实验的完整流程，帮助研究人员深入理解每个环节的关键要点，从而获得高质量、可信赖的实验数据。

膜蛋白的纯化过程中面临着不稳定、丰度低、难纯化等问题，无法得到高质量和纯度好的膜蛋白开展体外分子互作实验。在细胞中表达GFP/YFP-目标蛋白融合蛋白，利用细胞裂解上清液进行MST检测，解决难以重组表达纯化的蛋白不能做体外分子互作的难题。

研究蛋白与蛋白的相互作用常见的技术包括BiFC、FRET、BRET、Co-IP、Pull-down、酵母双杂交等，然而这些技术主要存在无法定量分析结合的强度及假阳性等问题。利用微量热泳动技术(MST)技术，可以定量分析蛋白质与蛋白结合亲和力。

在细胞中表达GFP/YFP-目标蛋白融合蛋白，将细胞裂解并离心后取上清液。直接利用细胞裂解上清液直接进行微量热泳动 (MST) 检测，解决难以重组表达纯化的蛋白不能做体外分子互作的难题。