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- 免疫荧光双标三色（切片） 两种靶蛋白共定位切片荧光成像实验外包
- 全国
- 2026年07月05日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 提供商：
上海经科化学科技有限公司
- 服务名称：
免疫荧光双标三色（切片）
- 规格：
张
一、服务简介
同源双标 TSA 技术原理
二、两套完整实验操作流程
方案一：异源双标操作步骤
- 石蜡切片脱蜡至水：三类脱蜡液各浸泡 10min，梯度无水乙醇清洗后蒸馏水漂洗；
- 抗原修复：PH8.0 EDTA 缓冲液微波处理，中火 8min→停火 8min→中低火 7min，防止缓冲液蒸干；冷却后 PBS 摇床洗涤 3 次，每次 5min，修复条件可根据组织调整；
- 组化笔沿组织边缘划线，防止抗体流失；
- 血清封闭：滴加 BSA 室温封闭 30min；一抗为山羊来源则更换驴血清；
- 混合一抗孵育：两种异源一抗按比例混合，4℃湿盒过夜孵育；
- 混合荧光二抗孵育：对应两种荧光二抗混合，室温孵育 50min；
- DAPI 避光孵育 10min 复染细胞核；
- 自发荧光淬灭剂处理 5min，流水冲洗 10min；
- PBS 洗涤后使用抗荧光淬灭封片剂封片；
- 切片上机全景扫描采集图像。
方案二：同源双标（TSA 法）操作步骤
- 石蜡切片脱蜡、抗原修复、组织划线流程同上；
- 双O水封闭：3% 双O水溶液避光孵育 25min，封闭内源过氧化物酶，PBS 洗净；
- 血清封闭：BSA 室温封闭 30min；山羊一抗采用兔血清封闭，其余使用 BSA；
- 首轮一抗 4℃湿盒过夜孵育；
- HRP 标记二抗室温孵育 50min；
- CY3/FITC 型 TSA 避光孵育 10min，TBST 多次洗涤；
- EDTA 缓冲液微波加热，洗脱本轮一抗、二抗；
- 第二轮一抗 4℃过夜孵育；
- 对应荧光二抗室温避光孵育 50min；
- DAPI 复染核、自发荧光淬灭、封片、扫描步骤同异源双标流程。
三、荧光成像参数
四、送样运输规范
- 冰冻切片：-20℃保存、运输；
- 石蜡切片：常温运输；
- 细胞爬片：PFA 固定 15min，无菌 PBS 漂洗浸泡，4℃冰袋低温运输。
五、交付成果
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文献和实验脱蜡和水化 将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ（10 min）。 再次浸入无水乙醇Ⅰ（5 min）-无水乙醇Ⅱ（5 min）-95%酒精（5 min）-80%酒精（5 min）-70%酒精（5 min），然后去离子水冲洗2次，每次2 min。 抗原修复 (可选) 将组织切片放入修复盒，然后加入适量 0.01M 枸橼酸缓冲液（pH 6.0）或 EDTA 修复液（pH 9.0），液面要浸没组织。 微波中档修复 10 min（液体沸腾时开始计时），此过程中勿使组织干片
对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在 1h 内完成观察，或于 4℃ 保存 4h ，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对照： （1） 阳性对照：阳性血清+荧光标记物； （2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物； （3）荧光标记物对照：PBS +荧光标记物。 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是 donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti
问：神经干细胞nestin和EphrinA4的免疫荧光双标怎么做？答：过程和一般的免疫染色一样就是封闭的时候用两种血清混合封闭1：1加入一抗和二抗的时候也是混合加入但是因为稀释浓度不好掌握最好提前作预试~补充一点，荧光双标记必须选择的一抗抗性不同，如一个是兔多抗，一个是鼠单抗，那么二抗分别采用抗兔，抗鼠的不同颜色标记的荧光二抗即可。
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