免疫荧光双标三色（切片）

一、服务简介

同源双标 TSA 技术原理

二、两套完整实验操作流程

方案一：异源双标操作步骤

1. 石蜡切片脱蜡至水：三类脱蜡液各浸泡 10min，梯度无水乙醇清洗后蒸馏水漂洗；
2. 抗原修复：PH8.0 EDTA 缓冲液微波处理，中火 8min→停火 8min→中低火 7min，防止缓冲液蒸干；冷却后 PBS 摇床洗涤 3 次，每次 5min，修复条件可根据组织调整；
3. 组化笔沿组织边缘划线，防止抗体流失；
4. 血清封闭：滴加 BSA 室温封闭 30min；一抗为山羊来源则更换驴血清；
5. 混合一抗孵育：两种异源一抗按比例混合，4℃湿盒过夜孵育；
6. 混合荧光二抗孵育：对应两种荧光二抗混合，室温孵育 50min；
7. DAPI 避光孵育 10min 复染细胞核；
8. 自发荧光淬灭剂处理 5min，流水冲洗 10min；
9. PBS 洗涤后使用抗荧光淬灭封片剂封片；
10. 切片上机全景扫描采集图像。

方案二：同源双标（TSA 法）操作步骤

1. 石蜡切片脱蜡、抗原修复、组织划线流程同上；
2. 双O水封闭：3% 双O水溶液避光孵育 25min，封闭内源过氧化物酶，PBS 洗净；
3. 血清封闭：BSA 室温封闭 30min；山羊一抗采用兔血清封闭，其余使用 BSA；
4. 首轮一抗 4℃湿盒过夜孵育；
5. HRP 标记二抗室温孵育 50min；
6. CY3/FITC 型 TSA 避光孵育 10min，TBST 多次洗涤；
7. EDTA 缓冲液微波加热，洗脱本轮一抗、二抗；
8. 第二轮一抗 4℃过夜孵育；
9. 对应荧光二抗室温避光孵育 50min；
10. DAPI 复染核、自发荧光淬灭、封片、扫描步骤同异源双标流程。

三、荧光成像参数

四、送样运输规范

1. 冰冻切片：-20℃保存、运输；
2. 石蜡切片：常温运输；
3. 细胞爬片：PFA 固定 15min，无菌 PBS 漂洗浸泡，4℃冰袋低温运输。

五、交付成果