【天然产物筛选靶蛋白】ABPP小分子靶点“垂钓”技术+Pul

【天然产物筛选靶蛋白】ABPP小分子靶点“垂钓”技术+Pull-down+CETSA+IF+siRNA揭示天然纳米颗粒作用机制

摘要

中药复方泻心汤煎煮过程中会产生自组装纳米颗粒，能有效缓解小鼠溃疡性结肠炎。研究利用ABPP、竞争性Pull-down及CETSA，证实了线粒体外膜蛋白VDAC1是其直接功能靶点，该结合可阻断NLRP3炎症小体的激活，从纳米医学角度阐明了中药复方的物质基础与分子机理。

文章思路

中医科学院中药研究所在国际学术期刊《Materials Today Bio》（一区，IF 10.3）上发表了最 新研究成果。该研究发现，传统中药方剂三黄泻心汤（XXD）在煎煮过程中可自组装形成天然纳米颗粒（XDNPs）。这些颗粒主要由小檗碱（BBR）和大黄酸（Rhein）通过非共价作用力驱动生成，该纳米制剂能显著减轻肠道病理损伤并改善肠道菌群失衡。

在靶点鉴定方面，研究者通过合成具有光活性基团的小檗碱探针（BBR-P），基于活性的蛋白质组分析（ABPP）技术在巨噬细胞内捕获候选蛋白。结合定量化学蛋白质组学分析，研究确定了线粒体外膜蛋白VDAC1是小檗碱的直接功能靶点。通过细胞热迁移（CETSA）、小分子Pull-down以及免疫荧光共定位，进一步证实了小檗碱与VDAC1的结合。

1.分子动力学模拟揭示组装机制

研究团队利用分子动力学（MD）模拟，从计算层面分析了小檗碱（BBR）与大黄酸（Rhein）自组装过程中的分子行为及其潜在驱动力。模拟结果显示，在0–100ns过程中，两种分子逐步靠近并发生聚集，分子趋于形成更加紧凑的构象。模拟轨迹显示，BBR与Rhein在水溶液中逐渐接近并形成稳定复合体，表明具有自发聚集的趋势。相互作用分析表明，该复合结构的稳定性由多种非共价相互作用共同维持，其中包括芳香环之间的π-π堆积、氢键作用以及疏水相互作用（图1）。

图 1 分子动力学模拟结果图

2.ABPP技术鉴定药物靶点

研究团队基于活性的蛋白质组分析（ABPP）这一化学蛋白质组学核心技术，精准鉴定了小檗碱（BBR）在细胞内的直接作用靶点。通过合成带有光活性基团和炔基标签的BBR探针（BBR-P），在紫外光照射下使探针与目标蛋白发生共价结合，随后通过点击化学反应引入生物素标签进行富集。

通过TMT标记定量质谱技术，研究者对BBR-P捕获的蛋白进行了全局分析。在生成的散点图中，VDAC1展现出极高的丰度比值和显著的统计学差异，从而VDAC1被鉴定为小檗碱的关键候选靶点（图2）。

图 2 ABPP筛选靶点

3.竞争性Pull-down验证蛋白之间的相互作用

研究团队通过竞争性Pull-down实验在体外水平进一步证实了BBR与VDAC1蛋白之间的相互作用。实验利用合成的小檗碱光亲和探针BBR-P与重组蛋白共同孵育，通过紫外光照射使探针与蛋白发生共价交联，随后利用点击化学反应连接荧光基团，并通过蛋白电泳进行检测。

竞争性小分子Pull-down结果显示，随着游离小檗碱浓度的增加，VDAC1蛋白处的荧光标记强度呈现显著的剂量依赖性减弱。该结果证实了小檗碱与VDAC1蛋白存在特异性相互作用，且这种结合可以被原药有效竞争，排除了探针产生的非特异性标记（图3）。

图 3 竞争性Pull-down结果图

4.CETSA验证药物与靶蛋白的相互作用

研究人员利用CETSA细胞热迁移验证了小檗碱（BBR）与靶蛋白VDAC1的相互作用。该技术基于配体结合后能增强目标蛋白热稳定性的原理，通过监测蛋白在不同温度梯度下的热变性程度来评估结合情况。

结果显示，在高温条件下，BBR处理组中的VDAC1蛋白仍保持较高的可溶性，而对照组蛋白则发生了明显的热变性沉淀，从而在细胞原位层面证实了小檗碱与VDAC1之间存在结合（图4）。

图 4 CETSA-WB结果图

5.小分子免疫荧光共定位分析

研究团队通过IF免疫荧光共定位在细胞原位层面验证了小檗碱（BBR）与靶蛋白VDAC1的空间分布关系。

结果显示：BBR-P与VDAC1蛋白在细胞质区域呈现出高度的空间重叠，通过加入过量的游离小檗碱进行竞争试验，观察到BBR-P的荧光信号被显著削弱，进一步证实了小檗碱与VDAC1之间的结合具有高度的选择性与特异性（图5）。

图 5 免疫荧光共定位结果图

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