shRNA干扰载体构建

摘要：和元设计针对human Oct-4的shRNA干扰片段。通过分子生物学手段将该干扰片段构建入慢病毒载体（pLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A- Puro）的U6启动子下游，该载体可以实现在干扰Oct-4基因的同时表达绿色荧光蛋白EGFP和puromycin抗性基因，前者便于观察载体工作状态，后者方便筛选Oct-4干扰的稳定细胞株。除了可以直接瞬时转染细胞用于Oct-4基因的干扰，该载体更可以包装慢病毒，用于稳定株的筛选以及在动物水平干扰Oct-4基因的表达。
关键词：Oct-4，RNAi， shRNA， EGFP， puromycin， lentivirus vector

一、 实验原理
RNA干扰（RNA interference， RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索 基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。shRNA作为RNA干扰的一种方法，是利用人源和鼠源的U6和H1等RNA聚合酶Ⅲ（pol Ⅲ）启动子转录短的干扰RNA (siRNA， 19-21个核苷酸的RNA 双链)的DNA分子。细胞内转录的shRNA被Dicer enzyme加工后掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex， RISC），引导核酸酶降解靶RNA。
shRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。病毒载体也可用于 siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便，而且转染效果更加稳定。
所选用的干扰载体pLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-Puro载体图谱如下。用Age I和EcoR I酶切切去U6启动子下游的ccdB毒性基因，插入待构建的shRNA序列。

二、 实验目的
和元构建带有EGFP荧光标记和puromycin抗性基因标记的human Oct-4干扰慢病毒载体。

三、 实验步骤
和元上海根据human Oct-4基因的转录本设计3到4个siRNA靶点，安排引物合成。将单链的引物退火成双链oligo序列，连接入双酶切线性化的RNA干扰载体，替换掉 原来的ccdB毒性基因。菌落PCR筛选转化子，筛选的的阳性克隆进行测序验证。测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提。实验共分以下8个主要步骤：
1. 干扰靶点设计和引物合成：
和元根据shRNA设计的一般原则以及和元生物的丰富经验，设计3到4个siRNA靶点，安排引物合成。
2. 引物退火形成带粘性末端的双链片段：
和元将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μM，互补单链各取30μL混合。然后将oligo混合物在水浴锅中95℃加热5min，然后水浴锅开盖置室温中自然冷却至室温， 形成双链oligo片段。取1μL用于后续的连接反应，其余-20℃保存。
3. 线性化表达载体的制备：
和元用限制性内切酶对表达载体的进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10 x反应Buffer 5μL，限制性内切酶各1μL，用水补足50μL，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖 凝电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。。
4. 干扰片段连接入表达载体：
和元连接反应体系

试剂	阳性对照( µl )	自连对照( µl )	连接组( µl )
退火的双链oligo 10mM	1	-	1
线性化的干扰载体40ng/µl	3	3	3
10×T4 DNA ligase Buffer	2	2	2
T4 DNA ligase	1	1	1
dd H2O	Up to 20	Up to 20	Up to 20

于16℃ 连接过夜。
说明：阳性对照所加的退火的双链oligo是以前退火好的验证好用的片段，和连接组所加的退火的双链oligo长度一样，但序列无关。
5. 感受态细胞的转化：
和元的DH5a感受态细胞的转化，详见《精编分子生物学实验指南》②
6. 菌落PCR鉴定阳性转化子：
和元将挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中，取1µl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：

7. 阳性克隆送测序：
和元菌落鉴定得到的阳性克隆，送测序公司进行测序验证。用VectorNTI软件比对测序结果，对测序结果进行分析。
8. 质粒小提：
和元测序通过的阳性克隆，安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

四、 和元生物实验结果
1. siRNA 序列和引物合成
siRNA 序列:

病毒载体构建框架:



DNA引物片段：
pY1001-1 CCGGAGAAAGAACTCGAGCAATTcTCAAGAGAAATTGCTCGAGTTCTTTCTTTTTTTg
pY1001-2 AATTCAAAAAAAGAAAGAACTCGAGCAATTTCTCTTGAgAATTGCTCGAGTTCTTTCT　
pY1002-1 CCGGCCGTGAAGCTGGAGAAGGATTCAAGAGATCCTTCTCCAGCTTCACGGTTTTTTg
pY1002-2 AATTCAAAAAACCGTGAAGCTGGAGAAGGATCTCTTGAATCCTTCTCCAGCTTCACGG　
pY1003-1 CCGGGCTTCAAGAACATGTGTAATTCAAGAGATTACACATGTTCTTGAAGCTTTTTTg
pY1003-2 AATTCAAAAAAGCTTCAAGAACATGTGTAATCTCTTGAATTACACATGTTCTTGAAGC　
pY1004-1 CCGGGGGAGGAGCTAGGGAAAGATTCAAGAGATCTTTCCCTAGCTCCTCCCTTTTTTg
pY1004-2 AATTCAAAAAAGGGAGGAGCTAGGGAAAGATCTCTTGAATCTTTCCCTAGCTCCTCCC　
pYNC-GP-1 CcggTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTg
pYNC-GP-2 aattcaaaaaTTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAA
 

2. 表达载体的线性化
用Age I和EcoR I对表达载体进行双酶切，胶回收8.2kb的载体片段，酶切图谱如下：

第一泳道：空质粒
第二泳道：1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、•1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
第三泳道：pLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-Puro载体Age I和EcoR I酶切后

3. 菌落PCR鉴定阳性克隆
用菌落PCR鉴定转化子，正向引物hU6-F2 TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG 位于人U6启动子序列中，反向引物pY-SEQR CTATTAATAACTAATGCATGGC位于CMV启动子的5端序列，阳性克隆得到331bp的片段，阴性对照得到586bp的片段。
pY1001菌落PCR鉴定图：

1. 阴性对照（空载体）
2. 阳性对照（pYNC-GP质粒）
3. DL2,000 DNA Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4~11 挑取的8个转化子

pY1002菌落PCR鉴定图：


1. 阴性对照（空载体）
2. 阳性对照（pYNC-GP质粒）
3. DL2,000 DNA Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4~11 挑取的8个转化子

pY1003菌落PCR鉴定图：

1. 阴性对照（空载体）
2. 阳性对照（pYNC-GP质粒）
3. DL2,000 DNA Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4~11 挑取的8个转化子

pY1004菌落PCR鉴定图：

1. 阴性对照（空载体）
2. 阳性对照（pYNC-GP质粒）
3. DL2,000 DNA Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4~11 挑取的8个转化子

4. 测序结果分析
pY1001测序结果
CCCCCCCATATCCAGCCTGTTGAGAGAATTGGATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGAGAAAGAACTCGAGCAATTCTCAAGAGAAATTGCTCGAGTTCTTTCTTTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATGGTGAGCATGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGTCGAGCTGGACGCGACGTAACGCACAGTTCAGCGTGTCGGCGAGGGCGAGGCGATGCCACCTACCGCAGCTGACCTGAAGTCATCTGACACGCAGCTGCTGACTTGACCACCTTTGACACCTGACTACGCGTGATGTCAGCGTAACCGACCATGAGACGACTCTCTAGTCCATGCCAGACTTCTAGAGGACAATTCTTCGAAGATAGAAGCGG

pY1002测序结果（由于发夹结构，2个阳性克隆测序测序都中断）
CAAACAGCCTGTTAGAGAGAAATTGGATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGCCGTGAAGCTG
Y1002-1 CCGGCCGTGAAGCTGGAGAAGGATTCAAGAGATCCTTCTCCAGCTTCACGGTTTTTTg

AATTAAGGGCCTGTTAGAGAGATAATTGGATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGCCGTGAAGCT
Y1002-1 CCGGCCGTGAAGCTGGAGAAGGATTCAAGAGATCCTTCTCCAGCTTCACGGTTTTTTg

pY1003测序结果
CAACCGGGCTTGGTTAGAGAGACATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAcAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGCTTCAAGAACATGTGTAATTCAAGAGATTACACATGTTCTTGAAGCTTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACGGGACGCCACCATGTGAGCAGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCTGTCGAGCTGACGCGACGTAACGCACAGTCAGCGTGTCGGCAGGCGAGGCGATGCACTACGCAGCTGACCTGAGTCATCTGCACACGCAGCTGCGTGCCTGTACTCGTGACCACCTGACCTACGCTGCATGCTCAGCGCTACCCGACCATGAAGCACCGACTCTCAGTCGCATGCCGAAGGCTCGTCCGGAGGCCAACTTCCAGGCACGGCATTCAGATCCCACCAGGTGAAGTTCCAGGGG

pY1004测序结果（由于发夹结构，阳性克隆测序测序中断）
CAAACCGGCCTGTTTAGAAGAGAAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGGGAGG
Y1004-1 CCGGGGGAGGAGCTAGGGAAAGATTCAAGAGATCTTTCCCTAGCTCCTCCCTTTTTTg

pYNC-GP测序结果
CTTTAATATACTTTGACTGTAAAAACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGGACGCCACCATGATGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACTTACGGGCAGCTGAACCCTTGAAAGTTCATCTGGCCCACCGGCAAGCTTGCCGTGACCTTGACCAGCCATCGTAACCACCCTGACCTACGCGTGCATGCTTCGGCGCTAACCCGGACATGAGCAGCACGGACTTCTTCAAGTTCGGCATGGCCGAGCTACGTCAGAGCGACATCTCTTCAAGACGACGCACTACAGATCCGACGCAGAGTGTAAATCA

五、 和元参考文献
1. F.M.奥斯伯等著，马学军等译，精编分子生物学实验指南（第四版），科学出版社，P57~58
2. F.M.奥斯伯等著，马学军等译，精编分子生物学实验指南（第四版），科学出版社，P25~26