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shRNA干扰载体构建

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shRNA干扰载体构建
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  • 上海
  • 和元以Oct-4基因为例,设计针对human Oct-4的shRNA干扰片段。通过分子生物学手段将该干扰片段构建入慢病毒载体(pLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A- Puro)的U6启动子下游,该载体可以实现在干扰Oct-4基因的同时表达绿色荧光蛋白EGFP和puromycin抗性基因
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  • 提供商: 和元生物
    服务名称: shRNA质粒构建
    规格: 按周期

    摘要:和元设计针对human Oct-4的shRNA干扰片段。通过分子生物学手段将该干扰片段构建入慢病毒载体(pLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A- Puro)的U6启动子下游,该载体可以实现在干扰Oct-4基因的同时表达绿色荧光蛋白EGFP和puromycin抗性基因,前者便于观察载体工作状态,后者方便筛选Oct-4干扰的稳定细胞株。除了可以直接瞬时转染细胞用于Oct-4基因的干扰,该载体更可以包装慢病毒,用于稳定株的筛选以及在动物水平干扰Oct-4基因的表达。
    关键词:Oct-4,RNAi, shRNA, EGFP, puromycin, lentivirus vector

    一、 实验原理
    RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,所以该技术已被广泛用于探索 基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。shRNA作为RNA干扰的一种方法,是利用人源和鼠源的U6和H1等RNA聚合酶Ⅲ(pol Ⅲ)启动子转录短的干扰RNA (siRNA, 19-21个核苷酸的RNA 双链)的DNA分子。细胞内转录的shRNA被Dicer enzyme加工后掺入RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC),引导核酸酶降解靶RNA。
    shRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。病毒载体也可用于 siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。
    所选用的干扰载体pLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-Puro载体图谱如下。用Age I和EcoR I酶切切去U6启动子下游的ccdB毒性基因,插入待构建的shRNA序列。

    二、 实验目的
    和元构建带有EGFP荧光标记和puromycin抗性基因标记的human Oct-4干扰慢病毒载体。

                                                                    

    三、 实验步骤
    和元上海根据human Oct-4基因的转录本设计3到4个siRNA靶点,安排引物合成。将单链的引物退火成双链oligo序列,连接入双酶切线性化的RNA干扰载体,替换掉 原来的ccdB毒性基因。菌落PCR筛选转化子,筛选的的阳性克隆进行测序验证。测序验证正确的克隆,进行高纯度质粒抽提。实验共分以下8个主要步骤:
    1. 干扰靶点设计和引物合成:
    和元根据shRNA设计的一般原则以及和元生物的丰富经验,设计3到4个siRNA靶点,安排引物合成。
    2. 引物退火形成带粘性末端的双链片段:
    和元将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μM,互补单链各取30μL混合。然后将oligo混合物在水浴锅中95℃加热5min,然后水浴锅开盖置室温中自然冷却至室温, 形成双链oligo片段。取1μL用于后续的连接反应,其余-20℃保存。
    3. 线性化表达载体的制备:
    和元用限制性内切酶对表达载体的进行酶切,酶切反应体系为:质粒2μg,10 x反应Buffer 5μL,限制性内切酶各1μL,用水补足50μL,于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝电泳检测酶切效果,并把目的载体条带从琼脂糖 凝电泳后的胶中割下来,用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收,具体步骤参考试剂盒说明书。。
    4. 干扰片段连接入表达载体:
    和元连接反应体系

    试剂 阳性对照( µl ) 自连对照( µl ) 连接组( µl )
    退火的双链oligo  10mM 1 - 1
    线性化的干扰载体40ng/µl 3 3 3
    10×T4 DNA ligase Buffer 2 2 2
    T4 DNA ligase 1 1 1
    dd H2O Up to 20 Up to 20 Up to 20

     

     

     




    于16℃ 连接过夜。
    说明:阳性对照所加的退火的双链oligo是以前退火好的验证好用的片段,和连接组所加的退火的双链oligo长度一样,但序列无关。
    5. 感受态细胞的转化:
    和元的DH5a感受态细胞的转化,详见《精编分子生物学实验指南》②
    6. 菌落PCR鉴定阳性转化子:
    和元将挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中,取1µl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下:

     

    7. 阳性克隆送测序:
    和元菌落鉴定得到的阳性克隆,送测序公司进行测序验证。用VectorNTI软件比对测序结果,对测序结果进行分析。
    8. 质粒小提:
    和元测序通过的阳性克隆,安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

    四、 和元生物实验结果
    1. siRNA 序列和引物合成
    siRNA 序列:
     

    病毒载体构建框架: 



     DNA引物片段:
    pY1001-1  CCGGAGAAAGAACTCGAGCAATTcTCAAGAGAAATTGCTCGAGTTCTTTCTTTTTTTg
    pY1001-2  AATTCAAAAAAAGAAAGAACTCGAGCAATTTCTCTTGAgAATTGCTCGAGTTCTTTCT 
    pY1002-1  CCGGCCGTGAAGCTGGAGAAGGATTCAAGAGATCCTTCTCCAGCTTCACGGTTTTTTg
    pY1002-2  AATTCAAAAAACCGTGAAGCTGGAGAAGGATCTCTTGAATCCTTCTCCAGCTTCACGG 
    pY1003-1  CCGGGCTTCAAGAACATGTGTAATTCAAGAGATTACACATGTTCTTGAAGCTTTTTTg
    pY1003-2  AATTCAAAAAAGCTTCAAGAACATGTGTAATCTCTTGAATTACACATGTTCTTGAAGC 
    pY1004-1  CCGGGGGAGGAGCTAGGGAAAGATTCAAGAGATCTTTCCCTAGCTCCTCCCTTTTTTg
    pY1004-2  AATTCAAAAAAGGGAGGAGCTAGGGAAAGATCTCTTGAATCTTTCCCTAGCTCCTCCC 
    pYNC-GP-1  CcggTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTg
    pYNC-GP-2  aattcaaaaaTTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAA

    2. 表达载体的线性化
    用Age I和EcoR I对表达载体进行双酶切,胶回收8.2kb的载体片段,酶切图谱如下:

                                                           
    第一泳道:空质粒
    第二泳道:1kb DNA ladder Marker:10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、•1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
    第三泳道:pLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-Puro载体Age I和EcoR I酶切后

    3. 菌落PCR鉴定阳性克隆
    用菌落PCR鉴定转化子,正向引物hU6-F2  TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG 位于人U6启动子序列中,反向引物pY-SEQR  CTATTAATAACTAATGCATGGC位于CMV启动子的5端序列,阳性克隆得到331bp的片段,阴性对照得到586bp的片段。
    pY1001菌落PCR鉴定图:
                                                   

    1. 阴性对照(空载体)
    2. 阳性对照(pYNC-GP质粒)
    3. DL2,000 DNA  Marker: 2 kb, 1 kb,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp
    4~11   挑取的8个转化子

    pY1002菌落PCR鉴定图:
     
                                                      
    1. 阴性对照(空载体)
    2. 阳性对照(pYNC-GP质粒)
    3. DL2,000 DNA  Marker: 2 kb, 1 kb,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp
    4~11   挑取的8个转化子

    pY1003菌落PCR鉴定图:
                                                    

     
    1. 阴性对照(空载体)
    2. 阳性对照(pYNC-GP质粒)
    3. DL2,000 DNA  Marker: 2 kb, 1 kb,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp
    4~11   挑取的8个转化子

    pY1004菌落PCR鉴定图:
           

                                                     

    1. 阴性对照(空载体)
    2. 阳性对照(pYNC-GP质粒)
    3. DL2,000 DNA  Marker: 2 kb, 1 kb,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp
    4~11   挑取的8个转化子

    4. 测序结果分析
    pY1001测序结果
    CCCCCCCATATCCAGCCTGTTGAGAGAATTGGATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGAGAAAGAACTCGAGCAATTCTCAAGAGAAATTGCTCGAGTTCTTTCTTTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATGGTGAGCATGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGTCGAGCTGGACGCGACGTAACGCACAGTTCAGCGTGTCGGCGAGGGCGAGGCGATGCCACCTACCGCAGCTGACCTGAAGTCATCTGACACGCAGCTGCTGACTTGACCACCTTTGACACCTGACTACGCGTGATGTCAGCGTAACCGACCATGAGACGACTCTCTAGTCCATGCCAGACTTCTAGAGGACAATTCTTCGAAGATAGAAGCGG

    pY1002测序结果(由于发夹结构,2个阳性克隆测序测序都中断)
    CAAACAGCCTGTTAGAGAGAAATTGGATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGCCGTGAAGCTG
    Y1002-1 CCGGCCGTGAAGCTGGAGAAGGATTCAAGAGATCCTTCTCCAGCTTCACGGTTTTTTg

    AATTAAGGGCCTGTTAGAGAGATAATTGGATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGCCGTGAAGCT
    Y1002-1 CCGGCCGTGAAGCTGGAGAAGGATTCAAGAGATCCTTCTCCAGCTTCACGGTTTTTTg

    pY1003测序结果
    CAACCGGGCTTGGTTAGAGAGACATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAcAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGCTTCAAGAACATGTGTAATTCAAGAGATTACACATGTTCTTGAAGCTTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACGGGACGCCACCATGTGAGCAGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCTGTCGAGCTGACGCGACGTAACGCACAGTCAGCGTGTCGGCAGGCGAGGCGATGCACTACGCAGCTGACCTGAGTCATCTGCACACGCAGCTGCGTGCCTGTACTCGTGACCACCTGACCTACGCTGCATGCTCAGCGCTACCCGACCATGAAGCACCGACTCTCAGTCGCATGCCGAAGGCTCGTCCGGAGGCCAACTTCCAGGCACGGCATTCAGATCCCACCAGGTGAAGTTCCAGGGG

    pY1004测序结果(由于发夹结构,阳性克隆测序测序中断)
    CAAACCGGCCTGTTTAGAAGAGAAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGGGAGG
    Y1004-1 CCGGGGGAGGAGCTAGGGAAAGATTCAAGAGATCTTTCCCTAGCTCCTCCCTTTTTTg

    pYNC-GP测序结果
    CTTTAATATACTTTGACTGTAAAAACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGGACGCCACCATGATGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACTTACGGGCAGCTGAACCCTTGAAAGTTCATCTGGCCCACCGGCAAGCTTGCCGTGACCTTGACCAGCCATCGTAACCACCCTGACCTACGCGTGCATGCTTCGGCGCTAACCCGGACATGAGCAGCACGGACTTCTTCAAGTTCGGCATGGCCGAGCTACGTCAGAGCGACATCTCTTCAAGACGACGCACTACAGATCCGACGCAGAGTGTAAATCA
     

    五、 和元参考文献
    1. F.M.奥斯伯等著,马学军等译,精编分子生物学实验指南(第四版),科学出版社,P57~58
    2. F.M.奥斯伯等著,马学军等译,精编分子生物学实验指南(第四版),科学出版社,P25~26

     

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